目的 膽道閉鎖(biliary atresia, BA)是嬰兒期引起膽汁淤積性黃疸的一種常見疾病,嚴(yán)重危及嬰幼兒生命。其發(fā)病率為1/14000-1/10000。臨床上常與新生兒特發(fā)性肝炎難鑒別。盡管隨著Kasai手術(shù)的廣泛開展,使膽道閉鎖患兒獲得更多的生存機(jī)會(huì),但在術(shù)后十年的生存率僅為10-20%,而且有70%-80%的患兒有進(jìn)行性的膽管破壞和肝纖維化,最終需要肝移植。BA病因至今尚不清楚,越來越多的人認(rèn)為圍生期病毒感染在BA的發(fā)生中起重要作用,而病毒感染通過哪些途徑導(dǎo)致膽管進(jìn)行性炎癥、退化及肝纖維化目前尚不清楚。 目前、研究認(rèn)為在組織器官慢性纖維化中,上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelium-mesenchymal transition, EMT)機(jī)制發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,EMT是指分化成熟的極化上皮細(xì)胞喪失上皮/內(nèi)皮細(xì)胞特征,向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,使其具有更大的活性和遷移性,這一過程在胚胎發(fā)育、組織再生、組織器官纖維化、癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下,EMT是組織器官重要的創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制,組織器官損傷后通過EMT機(jī)制形成纖維瘢痕達(dá)到創(chuàng)傷修復(fù),但這一過程持續(xù)存在則為病理狀態(tài),可造成組織器官纖維化、硬化,這種轉(zhuǎn)化機(jī)制在毛細(xì)支氣管、腎小管等管狀組織纖維化中的研究較早、報(bào)道較多,而且最近EMT已經(jīng)成為終止、逆轉(zhuǎn)腎臟損傷后腎小管進(jìn)行性纖維化的重要治療靶點(diǎn)。最近有研究認(rèn)為EMT可能是參與BA中硬化性膽管炎的重要病理機(jī)制,在此過程中膽管上皮細(xì)胞逐漸喪失上皮細(xì)胞特性,并逐漸表現(xiàn)出間充質(zhì)細(xì)胞特性,一系列重要的細(xì)胞因子CK-19、Fibronectin、TGF-β、Smad3和Hes-1等也參與了這一重要的病理過程。CK-19為膽管細(xì)胞特異性細(xì)胞因子,可直接反應(yīng)膽管上皮細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的變化；研究表明,Fibronectin為間充質(zhì)細(xì)胞特異性細(xì)胞因子,能直接影響細(xì)胞骨架成分的形成與組裝[7],增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附能力,在正常肝臟組織上皮類細(xì)胞中不表達(dá),若在BA患兒肝臟上皮類細(xì)胞中表達(dá),則可作為EMT機(jī)制激活的早期信號(hào)；轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1是體內(nèi)作用最強(qiáng)和最廣泛的影響纖維產(chǎn)生的細(xì)胞因子[8]，通過TGF-β、smad信號(hào)通路使纖維化過程持續(xù)并進(jìn)一步惡化[9-10]；Hes-1為胚胎發(fā)育過程中Notch信號(hào)通路的重要下游信號(hào),與先天性發(fā)育異常有密切關(guān)系,Hes-1的表達(dá)受Notch信號(hào)的調(diào)節(jié)[11]。但上述指標(biāo)在膽道閉鎖患兒肝臟組織膽管纖維化過程中是否起作用,又發(fā)揮著怎樣的作用等問題目前仍不清楚。因此本文從膽管上皮細(xì)胞是否發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、是否伴有纖維化等炎癥因子的參與、是否伴有胚胎發(fā)育信號(hào)的激活三方面綜合分析,對(duì)BA患兒膽管病理改變規(guī)律進(jìn)行深入研究,為進(jìn)一步探索新的治療方法奠定基礎(chǔ)。 本研究以經(jīng)手術(shù)證實(shí)為BA患兒的肝臟病理標(biāo)本和無肝膽系統(tǒng)畸形的同年齡段尸檢患兒肝臟標(biāo)本為研究對(duì)象,采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察CK-19、Fibronectin、TGF-β1、Smad3和Hes-1在肝臟組織中表達(dá)和分布情況,探討EMT機(jī)制在BA中發(fā)揮的作用,了解BA早期患兒肝臟組織膽管的病理變化規(guī)律,為深入了解BA患兒肝臟組織的病理演變規(guī)律提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 一、標(biāo)本制備及分組 經(jīng)術(shù)前超聲、MRCP、術(shù)中所見、術(shù)中膽道造影證實(shí)為BA患者25例為病例組,術(shù)中無菌取活檢肝組織約0.5cm×0.5cm×0.5cm大小病理標(biāo)本,用4%多聚甲醛固定；對(duì)照組為無肝膽系統(tǒng)畸形的同年齡段尸檢患兒5例,取肝組織,并用4%多聚甲醛固定。 二、免疫組織化學(xué)技術(shù) 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)CK-19、Fibronectin、TGF-β、Smad3和Hes-1在對(duì)照組和病例組肝臟組織標(biāo)本中的分布和表達(dá)情況。 三、數(shù)據(jù)分析 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示,數(shù)值比較采用t檢驗(yàn)分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、膽管上皮細(xì)胞特異性細(xì)胞因子CK-19在BA組肝臟組織免疫組化染色中表達(dá)顯著,大量毛細(xì)膽管增生,膽管失去正常管腔結(jié)構(gòu),無固定形態(tài),部分膽管上皮細(xì)胞表型喪失,形態(tài)不一,分布紊亂,且有膽汁淤積的膽管管腔結(jié)構(gòu)變化明顯,膽管上皮細(xì)胞形態(tài)變化嚴(yán)重。CK-19在病例組肝臟組織免疫組化染色中,平均膽管上皮陽性細(xì)胞數(shù)(96.33±3.28個(gè)/HP),多于對(duì)照組(20.58±1.15個(gè)/HP),平均光密度為0.413±0.058,高于對(duì)照組0.264±0.021,與對(duì)照組相比,P0.001,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、纖維化早期指標(biāo)Fibronectin在BA組肝臟組織免疫組化染色中,肝細(xì)胞間、匯管區(qū)纖維組織及膽管上皮細(xì)胞均有表達(dá),但在膽管上皮細(xì)胞表達(dá)顯著。Fibronectin在病例組肝臟組織免疫組化染色中,平均膽管上皮陽性細(xì)胞數(shù)為57.24±2.08個(gè)/HP,多于對(duì)照組的0個(gè)/HP,P0.001,病例組平均光密度為0.305±0.078高于對(duì)照組,對(duì)照組為0.093±0.001,P0.001,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1在BA患兒肝臟組織免疫組化染色中染色部位廣泛分布于肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、門管區(qū)部分纖維結(jié)構(gòu)及周邊其它細(xì)胞內(nèi),且肝細(xì)胞與周圍組織結(jié)構(gòu)染色更加明顯,較膽管上皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈。TGF-β1在病例組肝臟組織染色中,平均膽管上皮陽性細(xì)胞數(shù)(85.16±2.65個(gè)/HP),多于對(duì)照組(20.25±1.78個(gè)/HP),平均光密度為0.396±0.030,高于對(duì)照組0.241±0.021,與對(duì)照組相比,P0.001,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、Smad3在BA患兒肝臟組織免疫組化染色中,肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞均存在,且膽管上皮細(xì)胞染色明顯強(qiáng)于肝細(xì)胞,匯管區(qū)血管平滑肌細(xì)胞亦可呈輕度染色。Smad3在病例組肝臟組織免疫組化染色中,平均膽管上皮陽性細(xì)胞數(shù)(69.33±2.08個(gè)/HP),多于對(duì)照組(11.53±2.15個(gè)/HP),平均光密度為0.398±0.035,高于對(duì)照組0.254±0.028,與對(duì)照組相比,P0.001,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5、Hes-1在BA患兒肝臟組織免疫組化染色中,膽管上皮細(xì)胞染色明顯強(qiáng)于對(duì)照組,染色主要位于細(xì)胞胞漿,較多上皮細(xì)胞表現(xiàn)為間充質(zhì)細(xì)胞表型,相鄰細(xì)胞之間相互融合,分布紊亂。Hes-1在病例組肝臟組織免疫組化染色中,平均膽管上皮陽性細(xì)胞數(shù)(81.58±2.38個(gè)/HP),多于對(duì)照組(12.97±2.73個(gè)/HP),平均光密度為0.408±0.063,高于對(duì)照組0.231±0.015,與對(duì)照組相比,P0.001,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1、BA早期患者肝臟組織內(nèi)大量毛細(xì)膽管及膽管上皮細(xì)胞增生,結(jié)構(gòu)、形態(tài)及分布紊亂。 2、增生的膽管上皮細(xì)胞發(fā)生了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,EMT在膽管纖維化中發(fā)揮重要作用。 3、在膽管上皮細(xì)胞EMT過程中伴有胚胎發(fā)育相關(guān)基因信號(hào)通路Notch下游通路重新激活,并且伴有炎癥相關(guān)因子TGF-β1、Smad3等的激活、表達(dá)。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R726.5
【部分圖文】：

肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞均未見表達(dá)(圖I)。Hes一1在膽道閉鎖患兒肝臟組織中膽管上皮細(xì)胞表達(dá)明顯(圖J)。Hes一1在病例組肝臟組織免疫組化染色中，平均膽管上皮陽性細(xì)胞數(shù)(81.58士2.38個(gè)艦p)，多于對(duì)照組(12.97士2.73個(gè)/Hp)，平均光密度為0.408士0.063，高于對(duì)照組0.231士0.015，與對(duì)照組相比，P<0.001，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

【參考文獻(xiàn)】

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1 田棣;李文林;攸璞;金彩霞;朱吉;張南;胡以平;;Hes1基因誘導(dǎo)小鼠肝原始細(xì)胞分化為膽管上皮細(xì)胞(英文)[J];癌變.畸變.突變;2008年06期

本文編號(hào)：2817192