【摘要】： 目的： 隨著機(jī)械通氣和肺泡表面活性物質(zhì)、激素等的應(yīng)用及新生兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的發(fā)展,早產(chǎn)兒和極低體重兒的存活率明顯提高,早產(chǎn)兒肺部疾病的發(fā)病率也隨之增加。宮內(nèi)感染是影響肺正常發(fā)育的重要因素,宮內(nèi)感染可以引起肺部炎癥反應(yīng),增加肺表面活性物質(zhì)蛋白(surfactant protein, SP)的表達(dá),促進(jìn)肺成熟,降低新生兒呼吸窘迫綜合癥(respiratory distress syndrome, RDS)的發(fā)生。宮內(nèi)感染也是支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary disease, BPD)發(fā)生的重要原因之一。既往認(rèn)為BPD是長(zhǎng)期的機(jī)械通氣、高濃度氧療所致,而新型BPD的肺泡和氣道損傷、纖維化較輕,以炎癥導(dǎo)致的肺泡和肺微血管發(fā)育不良為主要特征。目前宮內(nèi)感染在肺發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制尚不十分明確,可能從以下幾方面影響肺發(fā)育：1.細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)：宮內(nèi)感染產(chǎn)生大量炎癥因子如白細(xì)胞介素(interieukin, IL)-1β,IL-6,IL-8及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-a等,引起肺局部炎癥、促進(jìn)肺部成熟；也可以導(dǎo)致肺發(fā)育受損。2.影響肺血管的發(fā)育：宮內(nèi)感染可能通過(guò)下調(diào)與肺血管發(fā)生形成相關(guān)的生長(zhǎng)因子,從而影響肺微血管的發(fā)育,阻礙肺泡化進(jìn)程,促進(jìn)支氣管肺發(fā)育不良的發(fā)生。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在肺組織內(nèi)表達(dá)豐富,可以通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體fms-樣酪氨酸激酶(fms-like tyrosine kinase, Flt-1)和胎肝激酶1(fetal liver kinase-1,Flk-1)結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)功能,是傳遞內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂信號(hào),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、分化,誘導(dǎo)肺血管發(fā)生的重要因子。3.早產(chǎn)：宮內(nèi)感染是導(dǎo)致早產(chǎn)的主要原因之一。早產(chǎn)兒肺發(fā)育仍處于小管期或者囊狀期,肺形態(tài)和功能都尚未成熟,外界刺激可引起肺發(fā)育停滯；而早產(chǎn)兒出生后更易暴露于機(jī)械通氣、高氧、氣壓傷、感染等不利因素中,可進(jìn)一步觸發(fā)肺部炎性因子瀑布反應(yīng),加重氣道、肺血管及間質(zhì)損傷,導(dǎo)致BPD的發(fā)生。 目前在關(guān)于宮內(nèi)感染對(duì)肺發(fā)育影響及其機(jī)制的研究中,多數(shù)使用內(nèi)毒素／脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)注射來(lái)建立感染模型,且研究時(shí)間多于孕后期(小管期以后),尤其以囊狀期到肺泡期為最多,而對(duì)于肺發(fā)育早期(假腺期)宮內(nèi)感染后的肺發(fā)育變化研究的仍較少。由于建立宮內(nèi)感染模型時(shí)的胎齡不同、方式不同或動(dòng)物品種的不同,研究者報(bào)道宮內(nèi)感染對(duì)肺發(fā)育的影響也不同。假腺期是肺發(fā)育過(guò)程中一個(gè)重要的時(shí)期。在假腺期內(nèi),肺內(nèi)氣道血管迅速分支；到假腺期末,肺導(dǎo)氣部氣道及伴行血管基本形成。因此,本研究選擇在假腺期,通過(guò)宮頸內(nèi)注射大腸桿菌液的方式建立宮內(nèi)感染模型,評(píng)價(jià)肺發(fā)育早期宮內(nèi)感染后胎鼠和新生大鼠體重、肺重、肺泡數(shù)目及結(jié)構(gòu)變化、肺表面活性物質(zhì)蛋白的表達(dá)；觀察TNF-α、IL-1β、VEGF及其受體Flt-1、Flk-1的表達(dá),從而來(lái)探討肺發(fā)育早期的宮內(nèi)感染對(duì)肺發(fā)育的影響及可能機(jī)制,為早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良等疾病的防治提供新的思路。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組和宮內(nèi)感染組,每組各22只大鼠。對(duì)照組為孕齡15天的大鼠左右兩側(cè)宮頸內(nèi)各注射生理鹽水0.2 mL,宮內(nèi)感染組為孕齡15天的大鼠左右兩側(cè)宮頸內(nèi)各注射大腸桿菌稀釋液0.2 mL。 2.標(biāo)本收集：分別按照宮內(nèi)感染后24小時(shí)及17、19、21日胎齡,將剖宮產(chǎn)獲得的胎鼠處死,收集胎肺組織；對(duì)自然分娩的新生大鼠按照1、3、7、14日齡4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行肺組織的收集,進(jìn)行灌注后迅速取出肺組織,將肺組織放于中性甲醛固定、石蠟包埋,或?qū)⒎谓M織經(jīng)液氮速凍后放至-80℃冰箱中保存。 3.實(shí)驗(yàn)方法：檢測(cè)兩組中胎鼠和新生大鼠的體重、肺重、肺重／體重；應(yīng)用蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色觀察兩組中17、19、21日胎齡和新生1、3、7、14日齡大鼠肺組織的病理變化特點(diǎn)；輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(radical alveolar counts,RAC),自呼吸性細(xì)支氣管中心到最近纖維膈或胸膜的垂直線上的肺泡數(shù)；免疫組化染色檢測(cè)兩組中17、19、21日胎齡和新生1、3、7、14日齡大鼠肺組織中SP-A、Flt-1和Flk-1的表達(dá)；Western blot法檢測(cè)兩組中17、19、21日胎齡和新生1、3、7、14日齡大鼠肺組織中VEGF的蛋白水平；熒光定量RT-PCR檢測(cè)兩組中17、19、21日胎齡和新生1、3、7、14日齡大鼠肺組織內(nèi)炎癥因子(TNF-α和IL-1β),肺表面活性物質(zhì)蛋白(SP-A和SP-B),和VEGF、Flt-1、Flk-1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1.44只孕鼠活動(dòng)、進(jìn)食均正常,無(wú)1例發(fā)生死亡。孕鼠分娩情況：對(duì)照組共獲158(158／161)只胎鼠和50(50／52)只新生大鼠,宮內(nèi)感染組共獲145(145／149)只胎鼠和55(55／60)只新生大鼠。宮內(nèi)大腸桿菌感染的孕鼠子宮壁及胎盤內(nèi)血管充血、水腫,并見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組的孕鼠子宮及病理檢測(cè)均未見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。 2.假腺期宮內(nèi)感染后,17、19、21日胎齡和新生1日齡的大鼠體重明顯降低；17、19、21日胎齡和新生1、3日齡的大鼠肺重明顯降低；17、19日胎齡的胎鼠肺重／體重比值明顯降低。 3.肺組織HE染色可見(jiàn)：19日胎齡的胎肺組織中,宮內(nèi)感染組的囊狀樣結(jié)構(gòu)少于對(duì)照組；宮內(nèi)感染組7日齡的新生大鼠肺組織中,肺泡膈少于對(duì)照組,肺泡數(shù)目減少,肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化；宮內(nèi)感染組14日齡新生大鼠肺組織中,肺泡數(shù)目減少,肺泡膈厚度增厚；宮內(nèi)感染組新生7、14日齡的大鼠肺組織RAC均明顯減少；兩組胎鼠和新生大鼠的肺組織內(nèi)均未見(jiàn)明顯肺實(shí)質(zhì)纖維化病變。 4.宮內(nèi)感染后24小時(shí)及17、19、21日胎齡的胎肺組織內(nèi)的TNF-α, IL-1βmRNA表達(dá),與對(duì)照組比沒(méi)有顯著差異；宮內(nèi)感染組新生1、3、7日齡大鼠肺組織內(nèi)TNF-αmRNA的表達(dá)水平顯著升高；宮內(nèi)感染組新生1、7、14日齡大鼠肺組織內(nèi)的IL-1βmRNA的表達(dá)水平顯著升高。 5.宮內(nèi)感染組17、19、21日胎齡的胎肺組織內(nèi)SP-A mRNA表達(dá)降低,19日胎齡的胎肺內(nèi)SP-A的蛋白水平降低；宮內(nèi)感染組19、21日胎齡的胎肺及新生7日齡大鼠肺組織內(nèi)SP-B mRNA表達(dá)減少。 6.宮內(nèi)感染組17、19日胎齡的胎肺內(nèi)VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,各時(shí)間點(diǎn)新生大鼠肺組織內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)在兩組內(nèi)無(wú)差異；宮內(nèi)感染組Flt-1和Flk-1在胎肺內(nèi)表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異,而新生7、14日齡大鼠肺組織內(nèi)的Flt-1和1、7、14日齡大鼠肺組織內(nèi)的Flk-1 mRNA較對(duì)照組明顯的升高,免疫組化顯示宮內(nèi)感染組新生7日齡的大鼠肺組織內(nèi)的Flk-1及Flt-1表達(dá)增多。 結(jié)論： 1.假腺期宮頸內(nèi)接種大腸桿菌建立的宮內(nèi)感染大鼠模型導(dǎo)致胎鼠體重、肺重及肺重／體重的降低；新生大鼠肺泡數(shù)目減少,肺泡膈減少、增厚,提示肺發(fā)育早期的宮內(nèi)感染使肺泡發(fā)育受損,導(dǎo)致了類似于BPD的病理變化。 2.假腺期宮內(nèi)大腸桿菌感染后胎肺組織內(nèi)SP-A和SP-B表達(dá)顯著下降,說(shuō)明肺發(fā)育早期宮內(nèi)感染抑制了胎肺中SP-A和SP-B的表達(dá),不能促進(jìn)胎肺的成熟。 3.假腺期宮內(nèi)大腸桿菌感染后,細(xì)胞因子INF-αIL-1β在新生大鼠肺組織內(nèi)表達(dá)增高,提示由宮內(nèi)感染導(dǎo)致的細(xì)胞因子反應(yīng)在肺發(fā)育受損的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。 4.假腺期宮內(nèi)大腸桿菌感染后,胎鼠和新生大鼠肺組織內(nèi)的VEGF、Flt-1和Flk-1表達(dá)紊亂,提示VEGF及其受體在肺發(fā)育中可能起著重要作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R722.1
【圖文】：

08060.2口口宮內(nèi)感染組組圈圈對(duì)照組組鬢鬢鬢蒙蒙蒙蒙蒙蒙蒙蒙蒙蒙蒙姍姍姍姍姍姍姍姍姍姍姍姍姍姍姍姍姍姍IIIIIIIiiiiiiiii鸚鸚鸚鸚鸚鸚鸚鸚鸚El下E19EZIP1P3P，P14圖LZ兩組胎鼠和新生大鼠的肺重比較注:‘表示尸<0.05，**表示尸<0.01，均表示與對(duì)照組比較.

圖1.4母鼠子宮的病理變化特點(diǎn)(HE染色:光鏡x200)A圖:宮內(nèi)感染后母鼠子宮粘膜層及粘膜下層可見(jiàn)血管充血、水腫，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);B圖:對(duì)照組母鼠子官粘膜層及粘膜下層未見(jiàn)明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及血管充血水腫。

圖1.4母鼠子宮的病理變化特點(diǎn)(HE染色:光鏡x200)A圖:宮內(nèi)感染后母鼠子宮粘膜層及粘膜下層可見(jiàn)血管充血、水腫，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);B圖:對(duì)照組母鼠子官粘膜層及粘膜下層未見(jiàn)明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及血管充血水腫。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2797271