【摘要】：川崎病(Kawasaki disease, KD)是一種兒童常見的急性全身性中小動(dòng)脈血管炎,目前已成為許多國(guó)家青少年兒童獲得性心臟病的首要原因。川崎病的發(fā)生機(jī)制仍不明確,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)S100A12-RAGE途徑在血管相關(guān)的炎癥疾病中有重要作用,其在川崎病血管病變中的重要作用與機(jī)制有待于進(jìn)一步明確。烏司他丁作為一種內(nèi)源性蛋白酶抑制劑,可以抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等,在不少疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。 通過(guò)馬血清誘導(dǎo)的仔豬冠狀動(dòng)脈損傷,建立免疫性血管炎模型；闡述S100A12-RAGE途徑在此免疫性冠狀動(dòng)脈損傷中的作用及機(jī)制；探討中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑烏司他丁、S100A12-RAGE途徑及馬血清誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈損傷之間的相互聯(lián)系,并評(píng)估此模型能否解釋川崎病的發(fā)生發(fā)展。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均采用純種長(zhǎng)白豬,1.5-3月齡,健康清潔級(jí),雄性,體重9-12Kg。第一部分：馬血清誘導(dǎo)仔豬“川崎病樣”冠狀動(dòng)脈炎模型的建立 11頭仔豬隨機(jī)分成四組,10ml/kg馬血清靜脈免疫動(dòng)物,間隔5天1次,共3次。將第一次注入血清的時(shí)間作為第0天,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察其臨床表現(xiàn),分別于實(shí)驗(yàn)的15天(5頭),20天(2頭),25天(2頭),30天(2頭),處死動(dòng)物,取新鮮帶心肌組織的冠狀動(dòng)脈標(biāo)本,中性福爾馬林固定,石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察冠狀動(dòng)脈病變情況。 第二部分：烏司他丁、S100A12-RAGE途徑及馬血清誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈病變間的作用研究 1、動(dòng)物模型 1)模型組(10頭)：稱取體重后,常規(guī)固定,力月西(咪達(dá)唑侖注射液)0.1ml/kg生理鹽水稀釋后肌肉注射,麻醉起效后,馬血清(Gibco,蛋白含量53g/L)免疫仔豬,用10ml/kg馬血清靜脈注射,間隔5天注射1次,共3次。 按時(shí)間順序分為三組,即實(shí)驗(yàn)第0天(自身正常對(duì)照),第10天(血清免疫完成時(shí),相當(dāng)于病程的第5天,急性期)、20天(相當(dāng)于病程的第15天,亞急性期)。第20天組再分為兩組,烏司它丁組與陽(yáng)性對(duì)照組。 ①烏司他丁組(5頭)：從馬血清免疫完成的第1天起(第11天),1萬(wàn)U/kg烏司他丁,用生理鹽水稀釋至20ml,靜脈注射,每天1次×3天,共飼養(yǎng)20天。 ②陽(yáng)性對(duì)照組(5頭)：從馬血清免疫完成的第1天起(第11天),生理鹽水20ml,靜脈注射,每天1次×3天,共飼養(yǎng)20天。 2)正常對(duì)照組(2頭)：與模型組相同環(huán)境,相同飼養(yǎng)條件,不予任何干預(yù)措施(HE染色和免疫組化染色時(shí)作為對(duì)照)。 所有動(dòng)物于第0天、10天、20天靜脈抽血10ml,第20天時(shí)10%氯化鉀心內(nèi)注射,處死動(dòng)物。 2、常規(guī)檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板、血清白蛋白、C反應(yīng)蛋白及紅細(xì)胞沉降率。 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞上S100A12及RAGE的表達(dá)水平及熒光強(qiáng)度。 4、組織石蠟切片、HE染色、S100A12及RAGE免疫組化染色。 第一部分：馬血清誘導(dǎo)仔豬“川崎病樣”冠狀動(dòng)脈炎模型的建立 1、病程中出現(xiàn)類似川崎病的臨床表現(xiàn)：發(fā)熱(體溫上升期伴寒戰(zhàn))、全身多形性皮疹、口唇紅、眼睛紅等。 2、大體肉眼觀：大體形態(tài)未見異常,冠狀動(dòng)脈及其主要分支未見串珠樣改變或明顯瘤樣擴(kuò)張現(xiàn)象。 3、HE染色結(jié)果：馬血清免疫的仔豬15天組主要以心肌炎癥為主,血管病變不明顯；20天組冠狀動(dòng)脈已有嚴(yán)重?fù)p傷,內(nèi)皮細(xì)胞浸潤(rùn),內(nèi)膜中斷,內(nèi)膜增厚,內(nèi)彈力纖維層破壞等表現(xiàn)均有存在；25天組,30天組損傷程度與第20天組無(wú)明顯差異。 第二部分：烏司他丁、S100A12-RAGE途徑及馬血清誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈病變間的作用研究 1、不同時(shí)間點(diǎn)血液學(xué)指標(biāo)：第0天(正常對(duì)照組),第10天(免疫完成組),第20天(烏司他丁組),第20天(陽(yáng)性對(duì)照組)各項(xiàng)指標(biāo)分別為白細(xì)胞(×109/L)：16.74±6.27,24.35±7.79,17.06±2.67,13.12±2.79；血紅蛋白(g/L)：103.60±10.71,106.60±10.53,103.60±8.44,104.00±6.36；血小板(×109/L)：1068.6±447.06,293.50±116.31,422.75±88.51,452.50±67.69；血清白蛋白(g/L)：39.33±5.04,28.86±3.77,36.52±2.58,34.62±4.03；C反應(yīng)蛋白(g/L)：均1；紅細(xì)胞沉降率(mm/h)：2.11±1.27,2.11±0.60,4.20±2.17,2.40±0.89。 2、S100A12與RAGE在CECs的表達(dá)：第0天(正常對(duì)照組),第10天(免疫完成組),第20天(烏司他丁組),第20天(陽(yáng)性對(duì)照組)各項(xiàng)指標(biāo)分別為CECs/MNC (%):0.49±0.44,0.58±0.38,0.33±0.13,0.39±0.16; S100A12-CECs/CECs (%): 87.61±8.72,91.33±9.67,89.31±8.96,94.02±2.83; FI-S100A12-CECs:200.28±79.75, 232.46±93.27,225.55±73.64,206.09±96.59; RAGE-CECs/CECs(%):96.16±10.42, 82.60±15.57,68.75±17.77,62.73±31.58; FI-RAGE-CECs:264.38±210.31, 122.98±76.16,185.25±103.46,151.21±78.54。 3、HE染色及S100A12、RAGE免疫組化結(jié)果： 1)HE染色陽(yáng)性對(duì)照組HE染色結(jié)果同模型建立時(shí)第20天的情況。烏司他丁的干預(yù)不能阻止冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮損傷,干預(yù)后皮疹處皮膚炎癥并未迅速消退。 2)S100A12石蠟切片的免疫組化染色 半定量計(jì)數(shù)法計(jì)算出每個(gè)視野S100A12陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)目,烏司他丁組：8.61+2.76；陽(yáng)性對(duì)照組：18.00±22.03；正常對(duì)照組：9.46±5.64。陽(yáng)性對(duì)照組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的部位高表達(dá)S100A12陽(yáng)性細(xì)胞,而血管內(nèi)皮細(xì)胞偶及S100A12細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)。 3) RAGE石蠟切片的免疫組化染色 RAGE主要表達(dá)于胞漿內(nèi),如心肌組織細(xì)胞核未明顯染色,胞漿強(qiáng)染。RAGE在冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞的免疫反應(yīng)積分(IRS)分別為,烏司它丁組：11.11±1.76,0.78±0.67,5.56±2.13；陽(yáng)性對(duì)照組：12.00±0.00,2.70±3.34,7.60±1.27；正常對(duì)照組：6.50±3.54,1.50±0.71,3.50±3.54。 1、S100A12-RAGE途徑參與馬血清誘導(dǎo)的免疫性冠狀動(dòng)脈損傷過(guò)程,S100A12對(duì)血管內(nèi)皮的攻擊可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落、內(nèi)皮損傷的直接原因。 2、免疫性血管炎狀態(tài)下,循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞及組織上S100A12及RAGE的表達(dá)隨著病情發(fā)展而發(fā)生變化,二者的變化處于不穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡中。 3、短期應(yīng)用烏司他丁,在一定程度上減緩了炎細(xì)胞的浸潤(rùn),但幾乎不能阻止馬血清所誘導(dǎo)的免疫性冠狀動(dòng)脈病變的進(jìn)展,其對(duì)S100A12-RAGE途徑的調(diào)節(jié)作用略顯微弱,需調(diào)節(jié)用法和劑量,多樣本分析。 4、馬血清誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈損傷模型并不是理想的川崎病冠狀動(dòng)脈損傷模型,因川崎病是一種多種免疫因素參與的血管炎性疾病,異種蛋白免疫所致的Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)動(dòng)物模型并不能完全代表川崎病。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R725.4
【圖文】：

第2次血清注射后，所有動(dòng)物的腹部出現(xiàn)大量紅色不規(guī)則皮疹，會(huì)陰部最為明顯，耳部及背部也有皮疹存在，第3次血清注射后5天，出現(xiàn)會(huì)陰部皮膚潰爛結(jié)癡表現(xiàn)(皮疹表現(xiàn)如圖3.1、3.2、3.3)，病程后期甲床邊緣出現(xiàn)橫溝(圖3.4)�？诖郊把劬σ灿邪l(fā)紅表現(xiàn)，但是唇紅色澤無(wú)川崎病患兒程度深。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未及明顯楊梅舌，雙側(cè)頸部未見明顯腫大淋巴結(jié)，手足硬腫程度與正常無(wú)明顯區(qū)別。即病程中出現(xiàn)的類似川崎病的臨床表現(xiàn):發(fā)熱(體溫上升期伴寒戰(zhàn))、全身多形性皮疹、口唇紅、眼睛紅等。圖3.1腹部典型皮疹:多形性紅斑圖3.2耳后粟粒樣皮疹

清注射完成相當(dāng)于病程的第5天。第一次靜脈注射血清時(shí)，n頭中有3頭出現(xiàn)寒戰(zhàn)、氣促表現(xiàn)，減慢輸注速度，表現(xiàn)持續(xù)到注射后10分鐘停止。l頭第一次輸注血清時(shí)出現(xiàn)一過(guò)性全身大片紅斑，為防止過(guò)敏性休克，暫停5分鐘后繼續(xù)輸注，紅斑消失。第2次血清注射后，所有動(dòng)物的腹部出現(xiàn)大量紅色不規(guī)則皮疹，會(huì)陰部最為明顯，耳部及背部也有皮疹存在，第3次血清注射后5天，出現(xiàn)會(huì)陰部皮膚潰爛結(jié)癡表現(xiàn)(皮疹表現(xiàn)如圖3.1、3.2、3.3)，病程后期甲床邊緣出現(xiàn)橫溝(圖3.4)�？诖郊把劬σ灿邪l(fā)紅表現(xiàn)，但是唇紅色澤無(wú)川崎病患兒程度深。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未及明顯楊梅舌，雙側(cè)頸部未見明顯腫大淋巴結(jié)，手足硬腫程度與正常無(wú)明顯區(qū)別。即病程中出現(xiàn)的類似川崎病的臨床表現(xiàn):發(fā)熱(體溫上升期伴寒戰(zhàn))、全身多形性皮疹、口唇紅、眼睛紅等。

圖3.3箭頭處皮膚潰爛，脫皮，結(jié)癡圖3.4甲床邊緣出現(xiàn)橫溝3.1.2心臟標(biāo)本大體肉眼觀:新鮮心臟標(biāo)本(連主動(dòng)脈根部)完整取出，大體形態(tài)未見異常，肉眼觀冠狀動(dòng)脈及其主要分支未見串珠樣改變或明顯瘤樣擴(kuò)張現(xiàn)象。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，僅30天組1頭仔豬的左冠狀動(dòng)脈起源異常，前降支與回旋支分別開口于不同的主動(dòng)脈的位置，且回旋支直徑寬于前降支。3.1.3冠狀動(dòng)脈及心肌的石蠟切片HE染色:判斷冠狀動(dòng)脈及心肌炎炎癥損傷情況。正常馬血清誘導(dǎo)，第20天時(shí)冠脈已有嚴(yán)重?fù)p傷，內(nèi)皮細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)膜中斷，內(nèi)膜增厚，內(nèi)彈力纖維層破壞等表現(xiàn)都有存在，25天組，30天組損傷程度與20天組無(wú)明顯差異，而第巧天時(shí)主要以心肌炎癥為主，血管病變不明顯。HE染色結(jié)果:心肌組織(圖3.5、3.6);冠狀動(dòng)脈(圖3.7、3.8、3.9、3.10):皮膚組織(圖3.11、3.12)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 鄧向紅;林茹珠;何庭宇;劉迪輝;黃良錦;劉嘵真;賴文英;阮兢;李明;;川崎病患兒紅細(xì)胞補(bǔ)體受體1數(shù)量基因多態(tài)性及紅細(xì)胞免疫的變化[J];臨床兒科雜志;2010年02期

2 覃麗君;牛美真;王宏偉;施虹;程佩萱;;干酪乳桿菌細(xì)胞壁成分誘導(dǎo)小鼠冠狀動(dòng)脈炎的實(shí)驗(yàn)研究[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2006年20期

3 李曉靜;程源山;楊默;;IL-1β與川崎病患兒血小板升高的關(guān)系[J];血栓與止血學(xué);2006年06期

4 王國(guó)兵;李成榮;祖瑩;袁雄偉;;Toll樣受體信號(hào)途徑活化在川崎病免疫發(fā)病機(jī)制中的作用[J];中華兒科雜志;2006年05期

5 常健;魯繼榮;梁東;李海波;陳銀波;趙紅霞;;川崎病患兒急性期Th1/Th2細(xì)胞功能狀態(tài)的研究[J];中華兒科雜志;2006年05期

6 王國(guó)兵;李成榮;祖瑩;;川崎病Toll樣受體MyD88非依賴性信號(hào)途徑及其調(diào)節(jié)因子的研究[J];中華兒科雜志;2007年11期

本文編號(hào)：2792746