【摘要】：第一部分cTnIR193H突變致限制性心肌病小鼠鈣調(diào)節(jié)基因和蛋白表達(dá)異常目的:心肌肌鈣蛋白I(cTnI)R193H基因突變可致限制性心肌病(RCM),心肌細(xì)胞對(duì)鈣敏感性增高是RCM心肌舒張功能障礙的關(guān)鍵因素,但其機(jī)理不明。磷酸二酯酶(PDE)是調(diào)控心肌細(xì)胞對(duì)鈣敏感性的重要因子,其能夠水解細(xì)胞內(nèi)cAMP的功能,影響PKA及其下游諸多鈣調(diào)蛋白,從而直接影響心肌細(xì)胞對(duì)鈣的敏感性。本部分研究將闡明cTnIR193H突變RCM小鼠心肌中,PDE及cAMP、PKA等鈣調(diào)節(jié)基因和蛋白的表達(dá)情況。方法:(1)通過cTnI-knockout C57小鼠及cTnIR193H(193)RCM小鼠雜交產(chǎn)生cTnIR193H+cTnI-knockout(193+KO)RCM小鼠。以野生型C57小鼠、193小鼠、193+KO小鼠為研究對(duì)象,193+KO小鼠由于cTnIR193H突變蛋白更多,因此RCM相關(guān)癥狀比193小鼠更重。與通過高頻超聲檢測(cè)各組小鼠心率。(2)通過q-PCR技術(shù)及western blot技術(shù)檢測(cè)各組小鼠心肌PDE4D基因和蛋白的表達(dá),PKA相關(guān)鈣調(diào)節(jié)基因的表達(dá),以及PKA、Ryr2磷酸化水平的檢測(cè)。通過Ellisa技術(shù)檢測(cè)各組小鼠心肌組織cAMP的水平。(3)以原代心肌細(xì)胞為研究對(duì)象,分為空轉(zhuǎn)組,PDE4D低表達(dá)組和cTnIR193H過表達(dá)組。利用cytation5儀器觀察PDE4D低表達(dá)心肌細(xì)胞和過表達(dá)cTnIR193H的心肌細(xì)胞搏動(dòng)速率。結(jié)果:(1)與野生型C57小鼠相比,193小鼠及193+KO小鼠心率增快(p0.05)。(2)193+KO小鼠鈣調(diào)節(jié)基因PKAcα、PKAcβ、Ryr2表達(dá)顯著高于野生組(p0.05),而PDE基因亞型PDE1B和PDE4D均較野生組顯著降低,且PDE4D降低更明顯(p0.05)。193+KO小鼠心肌PDE4D蛋白水平降低(p0.05),PKA和Ryr2蛋白磷酸化水平較野生組顯著升高(p0.05)。(3)193+KO小鼠心肌組織cAMP水平較野生組明顯升高(p0.05)。(4)過表達(dá)cTnIR193H的原代心肌細(xì)胞與PDE4D低表達(dá)的心肌原代細(xì)胞較對(duì)照組均出現(xiàn)了搏動(dòng)加快(p0.05)。結(jié)論:cTnIR193H突變RCM小鼠PKA信號(hào)通路活化引起心率增快可能與PDE4D低表達(dá)相關(guān)。第二部分組蛋白乙酰化修飾參與cTnIR193H限制性心肌病小鼠PDE4D低表達(dá)的調(diào)控目的:第一部分研究發(fā)現(xiàn),cTnIR193H突變RCM小鼠PDE4D低表達(dá)可能是引起PKA相關(guān)鈣調(diào)節(jié)基因改變的主要原因。但PDE4D低表達(dá)機(jī)制并不清楚。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)常見的調(diào)控機(jī)制之一,有研究顯示PDE受組蛋白修飾調(diào)控。本部分將以cTnIR193H突變RCM小鼠為研究對(duì)象,初步探討RCM小鼠心肌PDE4D低表達(dá)的組蛋白修飾調(diào)控機(jī)理。方法:(1)研究對(duì)象及分組為野生鼠,193和193+KO鼠。通過Ch IP技術(shù)檢測(cè)各組小鼠心肌中PDE4D基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白乙�；凹谆�。(2)q PCR檢測(cè)各種組蛋白乙酰化酶、去乙酰化酶、甲基化酶的基因表達(dá)水平。(3)通過Co IP實(shí)驗(yàn),篩選可以與cTnI相互作用的組蛋白修飾酶。(4)通過Ch IP技術(shù)檢測(cè)各組小鼠心肌中PDE4D基因啟動(dòng)子區(qū)域HDAC1和SMYD1的結(jié)合水平。結(jié)果:(1)與野生組相比,193+KO小鼠PDE4D啟動(dòng)子區(qū)域H3K4、H3K9乙酰化水平以及H3K4三甲基化水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(2)與野生組相比,組蛋白去乙酰化酶HDAC8和HDAC9 m RNA在193+KO小鼠中表達(dá)增加(p0.05),HDAC3 m RNA表達(dá)降低(p0.05),HDAC1和HDAC2 m RNA表達(dá)組間無差異(p0.05),組蛋白乙�；窯CN5及組蛋白甲基化酶SMYD1 m RNA在193+KO小鼠中表達(dá)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(3)Co IP顯示HDAC1陽性。(4)與野生組相比,193+KO小鼠PDE4D基因啟動(dòng)子區(qū)域,組蛋白去乙酰化酶HDAC1和組蛋白甲基化酶SMYD1的結(jié)合水平均增加(p0.05)。結(jié)論:(1)193+KO小鼠心肌組織PDE4D的降低,可能由HDAC1介導(dǎo)的組蛋白H3K4和H3K9乙酰化修飾調(diào)控。(2)cTnIR193H突變蛋白可能通過與HDAC1蛋白互作從而調(diào)控PDE4D的表達(dá)。第三部分cTnIR193H通過HDAC1介導(dǎo)組蛋白乙�；揎椪{(diào)控PDE4D低表達(dá)目的:第二部分研究提示PDE4D的低表達(dá)可能與HDAC1介導(dǎo)的組蛋白乙酰化修飾相關(guān)。作為RCM發(fā)病的始發(fā)因素,cTnI可與HDAC1相互作用。那么,cTnIR193H突變是否通過HDAC1介導(dǎo),調(diào)控PDE4D的低表達(dá)?本部分研究將在進(jìn)一步驗(yàn)證HDAC1調(diào)控PDE4D的基礎(chǔ)上,闡明cTnIR193H調(diào)控PDE4D的內(nèi)在機(jī)理。方法:(1)以原代心肌細(xì)胞為研究對(duì)象分為空轉(zhuǎn)組(NC),過表達(dá)HDAC1組(AV-HDAC1),過表達(dá)cTnI組(AV-cTnI)及過表達(dá)cTnIR193H組(AV-cTnIR193H),通過q PCR和WB檢測(cè)PDE4D基因和蛋白的表達(dá)。(2)通過Ch IP,檢測(cè)PDE4D基因啟動(dòng)子區(qū)域cTnI、cTnIR193H、HDAC1結(jié)合水平及H3K4、H3K9乙�；健�(3)通過免疫熒光技術(shù),證明cTnI入核。通過WB比較cTnI和cTnIR193H的入核能力。(4)通過Co IP技術(shù),比較cTnI和cTnIR193H與HDAC1的結(jié)合能力。(5)以293A細(xì)胞為研究對(duì)象,分為空載組,cTnI組及cTnIR193H組。通過熒光酶素報(bào)告實(shí)驗(yàn),檢測(cè)cTnI和cTnIR193H對(duì)PDE4D啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果:(1)與NC組比較,HDAC1過表達(dá)組PDE4D蛋白水平明顯降低(p0.05),PDE4D基因啟動(dòng)子區(qū)域HDAC1的結(jié)合水平顯著增加,H3K4和H3K9乙酰化的水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(2)心肌細(xì)胞核可觀察到cTnI入核,且核內(nèi)cTnI和cTnIR193H的量無明顯差異(p0.05)。(3)與空轉(zhuǎn)組比較,cTnI對(duì)PDE4D啟動(dòng)子上游2000bp的熒光值增加(p0.05)。而cTnIR193H對(duì)PDE4D啟動(dòng)子上游2000b的熒光值沒有明顯的改變(p0.05)。(4)與空轉(zhuǎn)組比較,過表達(dá)cTnIR193H后PDE4D基因和蛋白的表達(dá)顯著降低(p0.05)。過表達(dá)cTnI后PDE4D m RNA水平明顯增加(p0.05),但蛋白水平?jīng)]有明顯改變(p0.05)。(5)cTnI和cTnIR193H均能結(jié)合PDE4D啟動(dòng)子區(qū)域,且相對(duì)結(jié)合量無明顯差別(p0.05)。與cTnI組相比,cTnIR193H組PDE4D啟動(dòng)子區(qū)域HDAC1結(jié)合水平明顯增加,且H3K4、H3K9乙�；斤@著降低(p0.05)。(6)與cTnI相比,cTnIR193H結(jié)合HDAC1的量明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:cTnIR193H突變通過與HDAC1相互作用,增加PDE4D啟動(dòng)子區(qū)域HDAC1結(jié)合水平,降低ac H3K4和ac H3K9的水平,從而抑制PDE4D基因和蛋白的表達(dá)。第四部分EGCG抑制cTnIR193H與HDAC1結(jié)合而改善cTnIR193H突變致PDE4D低表達(dá)目的:第三部分研究提示HDAC1介導(dǎo)cTnIR193H調(diào)控PDE4D低表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)EGCG可抑制HDAC1介導(dǎo)的組蛋白乙�；揎棌亩岣呋虻谋磉_(dá),且EGCG對(duì)cTnIR193H限制性心肌病小鼠心功能有明顯的改善作用。因此本部分選擇EGCG作為干預(yù)劑,明確EGCG對(duì)cTnIR193H突變致PDE4D低表達(dá)的改善作用,并探討其內(nèi)在機(jī)理。方法:(1)以原代心肌細(xì)胞為研究對(duì)象,分為空轉(zhuǎn)組、cTnIR193H組和cTnIR193H+EGCG干預(yù)組,通過q-PCR和WB技術(shù)檢測(cè)PDE4D基因和蛋白的表達(dá)。(2)通過Ch IP技術(shù)檢測(cè)各組PDE4D啟動(dòng)子區(qū)域HDAC1結(jié)合水平和cTnIR193H結(jié)合水平。(3)通過Co IP技術(shù),檢測(cè)EGCG對(duì)cTnIR193H和HDAC1結(jié)合力的影響,以及EGCG對(duì)HDAC1活性的影響。結(jié)果:(1)與對(duì)照組相比,cTnIR193H組PDE4D基因和蛋白水平降低(p0.05),EGCG干預(yù)后,PDE4D表達(dá)水平較cTnIR193H組顯著增加(p0.05)。(2)與對(duì)照組相比,cTnIR193H組PDE4D啟動(dòng)子區(qū)域HDAC1結(jié)合量增加(p0.05)。EGCG干預(yù)后cTnIR193H組PDE4D啟動(dòng)子區(qū)域cTnIR193H和HDAC1結(jié)合水平顯著降低(p0.05),ac H3K4及ac H3K9水平顯著增加(p0.05)。(3)與cTnIR193H組比較,EGCG干預(yù)后cTnIR193H與HDAC1的結(jié)合量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(3)各組HDAC1的活性沒有明顯的改變(p0.05)。結(jié)論:EGCG通過抑制PDE4D啟動(dòng)子區(qū)域cTnIR193H與HDAC1結(jié)合而改善cTnIR193H突變致PDE4D低表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R725.4
【圖文】：

圖 1.2 PKA 鈣調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá) n=6，*表示 p<0.05，與 WT 組比較Fig.1.2. Expression of genes associated with PKAn=6, * means p<0.05 vs WT group.表 1.1 PKA 鈣調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá) n=6，*表示 p<0.05，與 WT 組比較Tab.1.1 Expression of genes associated with beta adrenergic activity n=6, * means p<0.05 vsWT group.基因 WT 193 193+KOADRB1 1.000±0.000 1.130±0.339 0.645±0.329*ADRB2 1.000±0.000 1.029±0.330 1.050±0.200PKAcα 1.000±0.000 1.250±0.621 4.110±1.254*PKAcβ 1.000±0.000 1.616±0.688 3.530±1.072*Ryr2 1.000±0.000 1.629±0.486 2.581±0.985*

圖 1.3 PKA 及 Ryr2 蛋白磷酸化水平 n=6，*表示 p<0.05，與 WT 組比較Fig.1.3. Phosphorylation level of PKA and Ryr2 n=6, * means p<0.05 vs WT group.表 1.2 PKA 及 Ryr2 蛋白磷酸化水平 n=6，*表示 p<0.05，與 WT 組比較Table.1.2. Phosphorylation level of PKA and Ryr2 n=6, * means p<0.05 vs WT group.蛋白名稱 WT 193 193+KOp-PKA 1.000±0.000 0.841±0.061 1.540±0.150*p-Ryr2 1.000±0.000 0.965±0.158 1.941±0.138*ELISA 結(jié)果顯示，與 WT 組相比較，193+KO 組小鼠心肌中 cAMP 水平明顯

圖 1.4 各組小鼠心肌中 cAMP 含量 n=6，*表示 p<0.05，與 WT 組比較Fig.1.4. The level of cAMP among groups. n=6, * means p<0.05 vs WT group.表 1.3 各組小鼠心肌中 cAMP 含量 n=6，*表示 p<0.05，與 WT 組比較Table.1.3. level of cAMP. n=6, * means p<0.05 vs WT group.WT 193 193+KOcAMP 112.561±84.320 70.634±37.749 214.078 ±119.232*2.3 cTnIR193H 突變 RCM 小鼠心肌中 PDE4D 的表達(dá)如圖 1.5A 所示，與對(duì)照組相比，在心臟中表達(dá)的 PDE1B,1C,2A,3A 和 4D 中，PDE1B 和 PDE4D 在 193+KO 組中表達(dá)顯著降低，差異既有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。

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