【摘要】： 背景與目的 新生兒缺氧缺血性腦病(Hypoxic-Ischemic Encephalopathy, HIE)是圍生期窒息后的主要并發(fā)癥之一,中、重度HIE幸存者中有25%將出現(xiàn)永久性的神經(jīng)功能障礙,是腦性癱瘓的主要病因。由于新生兒缺氧缺血性腦病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前,國內(nèi)外尚沒有公認(rèn)的特效的治療方法,許多神經(jīng)保護(hù)治療方法都處于探索階段,尋找更為有效的治療HIE方法仍然是圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的重要課題之一。 HIE損傷從開始一直延續(xù)到復(fù)蘇后的再灌注期間,其發(fā)病機(jī)制包括腦血流量失調(diào)、無氧代謝增加、ATP減少、低血糖、高乳酸血癥、興奮性氨基酸增加、細(xì)胞內(nèi)鈣離子聚集、一氧化氮合成的激活、氧自由基及炎癥因子的產(chǎn)生、神經(jīng)元遲發(fā)型死亡(凋亡)等,這些發(fā)病機(jī)制是研發(fā)腦損傷后神經(jīng)保護(hù)療法的基礎(chǔ)。近年來,國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)環(huán)磷腺苷(Cyclic Adenosine-3'5'-monophosphata, cAMP)參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制,在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中也占有重要的地位。 cAMP是細(xì)胞內(nèi)傳遞激素和遞質(zhì)的中介因子,因此也被稱為“第二信使”。細(xì)胞內(nèi)cAMP由ATP經(jīng)腺苷酸環(huán)化酶(AC)催化而成,由磷酸二酯酶(PDE)水解而降解,由此保持細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的穩(wěn)定性。研究表明cAMP在神經(jīng)代謝調(diào)控中起重要作用,細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的改變能影響多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而調(diào)控基因表達(dá)、蛋白活性及細(xì)胞功能,對(duì)細(xì)胞的分化、生長、代謝及調(diào)亡過程發(fā)生影響。臨床研究發(fā)現(xiàn)新生兒窒息后腦脊液中cAMP水平下降,且cAMP的水平與病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān),新生動(dòng)物缺氧缺血性腦損傷實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這一發(fā)現(xiàn),提示cAMP可能參與了新生兒缺血缺氧腦損傷的發(fā)病機(jī)制。由此可以設(shè)想,缺血缺氧損傷后及時(shí)補(bǔ)充外源性cAMP,或給予延緩cAMP降解的藥物,提高cAMP水平,在早期阻止cAMP信號(hào)途徑失調(diào)導(dǎo)致的瀑布效應(yīng),可能會(huì)顯著地減輕缺血缺氧造成的損傷,促進(jìn)損傷神經(jīng)元功能的恢復(fù)。 外源性cAMP:環(huán)磷腺苷在臨床上已廣泛用于治療心功能不全,其安全性和有效性早已得到公認(rèn),對(duì)新生兒窒息后心肌損傷也有一定的治療作用。二丁酰環(huán)磷腺苷(N6,2'-O-Dibutanoylcyclicadenosine 3',5'-monophosphate sodium salt, db-cAMP)也叫雙丁環(huán)腺苷鈉,是環(huán)磷腺苷的新型衍生物,作用和用途與環(huán)磷腺苷相同,在所有cAMP類似物中膜滲透性最強(qiáng),可直接增加細(xì)胞內(nèi)cAMP含量。研究發(fā)現(xiàn)db-cAMP能增強(qiáng)心肌收縮力,降低血管阻力,改善外周循環(huán),促進(jìn)胰島素分泌,促進(jìn)組織攝入糖等。近年來研究發(fā)現(xiàn)db-cAMP在在體和離體條件下都能直接促進(jìn)神經(jīng)生長,db-cAMP能否改善新生兒缺血缺氧性腦損傷少有報(bào)道。 磷酸二酯酶(PDE)抑制劑：氨茶堿為黃嘌呤類藥物,為茶堿與乙二胺復(fù)鹽,為非選擇性磷酸二酯酶(PDE)抑制劑,包括抑制主要水解cAMP的PDE3、PDE4,使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。氨茶堿除有強(qiáng)心利尿、抗炎、免疫調(diào)節(jié),興奮呼吸中樞等作用外,氨茶堿還可以減緩成人及低體重新生兒的腦血流速度,改善缺血后腦水腫和腦損傷以及降低實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠的死亡率。但氨茶堿對(duì)缺血缺氧性腦損傷保護(hù)作用的機(jī)理研究尚不深入。 本實(shí)驗(yàn)擬采用大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞缺氧葡萄糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)模型,初步探討給予外源性新型cAMP類藥物(db-cAMP)提高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度,以及給予非選擇性磷酸二酯酶(PDE)抑制劑氨茶堿減緩細(xì)胞內(nèi)cAMP降解及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)缺血缺氧神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用以及可能的機(jī)制,試圖為新生兒HIE的臨床治療提供新的思路與方法。 研究方法 1.PC12缺氧葡萄糖剝奪模型的建立： 細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)行OGD處理：細(xì)胞吸去培養(yǎng)液,以無糖平衡鹽緩沖液(Earle's balanced salt solution, EBSS)輕輕沖洗兩遍,并加入無糖平衡鹽緩沖液,置于缺氧培養(yǎng)箱N2／C02／02(94%／5%／1%)條件下進(jìn)行OGD損傷處理4h后,將液體換成DMEM培養(yǎng)液復(fù)氧24h。對(duì)照組細(xì)胞在含葡萄糖平衡鹽緩沖液置于C02培養(yǎng)箱培養(yǎng),4h后將液體換成含糖DMEM培養(yǎng)液。 2.PC12細(xì)胞活性的檢測 PC12細(xì)胞OGD處理4小時(shí)并復(fù)氧24小時(shí)后,加入MTT,37℃孵育4h,去除培養(yǎng)液,并加入二甲基亞砜(DMSO)低速振蕩,使結(jié)晶物充分溶解,酶標(biāo)儀測定570nm波長的吸光度(OD值),并設(shè)置空白對(duì)照孔,細(xì)胞各孔吸光度減去空白對(duì)照孔的吸光度即為PC12細(xì)胞產(chǎn)生吸光度。細(xì)胞吸光度可直接反應(yīng)細(xì)胞活性。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。 3.MTT法篩選氨茶堿和db-cAMP單獨(dú)或聯(lián)合用藥的最佳濃度 3.1氨茶堿最佳濃度篩選：試驗(yàn)分為正常對(duì)照組和OGD組,OGD組分為未用藥組和氨茶堿藥物組,根據(jù)文獻(xiàn),氨茶堿藥物濃度初步定為1×10-2mg/L、3×10-2mg/L.8×10-2mg/L和10×10-2mg/L濃度組。 3.2 db-cAMP最佳濃度篩選：試驗(yàn)分為正常對(duì)照組和OGD組,OGD組分為未用藥組和db-cAMP藥物組,根據(jù)文獻(xiàn),db-cAMP藥物濃度初步設(shè)定為1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10mol/L和1×10-3mol/L濃度組。 3.3 db-cAMP和氨茶堿聯(lián)合用藥最佳濃度篩選：試驗(yàn)分為正常對(duì)照組和OGD組,OGD組分為未用藥組和聯(lián)合用藥組,根據(jù)不同的藥物濃度分為聯(lián)合用藥Ⅰ組：氨茶堿1×10-2mg/L+db-cAMP1×10-6mol/L、Ⅱ組：氨茶堿3×10-2mg/L+db-cAMP1×10-5mol/L、Ⅲ組：氨茶堿5×10-2mg/L+db-cAMP1×10-4mol/L濃度組。 4.氨茶堿和db-cAMP單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞活性的影響 試驗(yàn)分為正常對(duì)照組和OGD組,OGD組分為未用藥組和藥物組,根據(jù)不同藥物分為氨茶堿組、db-cAMP組和兩藥聯(lián)合用藥組。細(xì)胞活性檢測的方法同上。 5.氨茶堿和db-cAMP單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 Hoechst33342熒光染料測定細(xì)胞凋亡,PC12細(xì)胞OGD損傷后復(fù)氧24h,棄去培養(yǎng)液,用PBS漂洗后加入固定液固定細(xì)胞,再用PBS液漂洗。自然干燥,加入Hoechst33342熒光染料,室溫下避光染色,PBS液再漂。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)并計(jì)數(shù),被染上熒光表示細(xì)胞已經(jīng)凋亡。計(jì)數(shù)細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率用凋亡細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比表示。分組同上。 6.氨茶堿和db-cAMP及兩藥聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響 PC12細(xì)胞經(jīng)OGD和復(fù)氧24h后,收集細(xì)胞用D-Hanks液洗,臺(tái)盼藍(lán)染色,計(jì)數(shù)活細(xì)胞為95%以上,加入鈣熒光指示劑Fura-2/AM,37℃負(fù)載。D-Hanks液洗滌后,使用雙波長熒光分光光度計(jì)檢測,激發(fā)光波長為340nm,發(fā)射光波長為500nm,狹縫10nm,測得樣品熒光值F,再加入曲拉通-100(TritonX-100)測熒光值Fmax,加入鈣離子螯合劑乙二醇-雙-2-氨基乙基四乙酸(EGTA)測熒光值Fmin,按下面公式求出[Ca2+]i,Kd在37℃為224 nmol/L。分組同上。[CA2+]i(nmol/L)=Kd(F-Fmin)/Fmax-F 7.氨茶堿和db-cAMP及兩藥聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞內(nèi)caspase-3凋亡酶活性的影響 按Caspase-3活性檢測試劑盒說明檢測caspase-3凋亡酶活性,步驟如下(1)測定4-硝基苯胺(pNA)和總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)樣品收集：細(xì)胞經(jīng)OGD損傷和藥物處理后收集細(xì)胞,加入裂解液裂解離心,收集上清；(3)caspase-3凋亡酶活性檢測：設(shè)置空白對(duì)照孔和樣品孔,在37℃孵育4h,在A405酶標(biāo)儀下檢測,樣品A405扣除空白孔A405即為樣品中caspase-3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度,通過步驟1中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以計(jì)算出樣品中催化產(chǎn)生的pNA的量;(4) Bradford法檢測樣品總蛋白濃度；(5)計(jì)算caspase-3凋亡酶活力單位。分組同上。 8.MTT法檢測db-cAMP對(duì)PC12細(xì)胞保護(hù)作用的時(shí)間窗 用MTT方法檢測細(xì)胞活性,方法同前。試驗(yàn)分為正常對(duì)照組和OGD組,OGD組分為未用藥組和藥物組,用藥組根據(jù)不同加藥時(shí)間分為Oh組,1h組,2h組,4h組,8h組,16h組。 9.統(tǒng)計(jì)方法 各組數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(×±s)表示,所有計(jì)量資料間比較在確定方差齊性后(P0.05),各組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),各組均數(shù)間的多重比較采用LSD法(Least-significant difference test)或SNK法,如果方差不齊則用Welch法,各組間多重比較采用dunnett's T3檢驗(yàn)。兩處理組均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn),P0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.建立PC12缺氧葡萄糖剝奪模型 氧葡萄糖剝奪復(fù)氧后,與正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞相比,OGD后PC12細(xì)胞活性下降35.71%,細(xì)胞凋亡率升高31.57%,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加到286.182nmol/L(對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度為121.094 nmol/L),細(xì)胞內(nèi)caspase-3凋亡酶活性增高4.444單位(對(duì)照組未檢測到有活性的caspase-3凋亡酶)。 2.氨茶堿、db-cAMP和聯(lián)合用藥最佳濃度 通過MTT篩選藥物濃度,氨茶堿組濃度為5×10-2mg/L, db-cAMP組濃度1×10-4mol/L,聯(lián)合用藥組濃度氨茶堿3×10-2mg/L+db-cAMP1×10-5mol/L,分別為該藥物提高細(xì)胞活性的最佳濃度。 3.氨茶堿和db-cAMP單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞活性的影響 氨茶堿組與未用藥組比較細(xì)胞活性無顯著提高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.167)：db-cAMP組和聯(lián)合用藥組與未用藥組比較細(xì)胞的活性顯著增加(P=0.001,P=0.000),顯示OGD后使用db-cAMP單獨(dú)和聯(lián)合使用氨茶堿可提高PC12細(xì)胞活性。 4.氨茶堿和db-cAMP單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 氨茶堿組與未用藥組比較,細(xì)胞凋亡率無顯著降低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.194)：db-cAMP組和聯(lián)合用藥組與未用藥組比較凋亡率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004,P=0.002),顯示OGD后使用db-cAMP單獨(dú)和聯(lián)合使用氨茶堿可降低PC12細(xì)胞凋亡率。 5. db-cAMP和聯(lián)合用藥能降低OGD損傷后PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度 氨茶堿組與未用藥組比較細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無顯著降低,差異物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.751)；db-cAMP和聯(lián)合用藥組與未用藥組比較細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038,P=0.020),顯示OGD后使用db-cAMP單獨(dú)和聯(lián)合使用氨茶堿可降低PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。 6.各組藥物對(duì)OGD損傷后PC12細(xì)胞中caspase-3凋亡酶活性作用不明顯 正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未檢測到有活性的caspase-3凋亡酶,OGD各組細(xì)胞內(nèi)檢測到有活性caspase-3凋亡酶；氨茶堿、db-cAMP和聯(lián)合組與未用藥組比較Caspase-3凋亡酶活性降低無明顯差異(P0.05)。顯示OGD復(fù)氧后各組藥物對(duì)降低細(xì)胞中caspase-3凋亡酶活性作用不明顯。 7. db-cAMP對(duì)PC12細(xì)胞保護(hù)作用的時(shí)間窗 0h,1h,2h,4h組與未用藥組比較細(xì)胞活性增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),4h及之前不同時(shí)間點(diǎn)給藥均能提高細(xì)胞的存活率；4h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)給藥組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；8h和16h給藥細(xì)胞活性與未用藥組比較細(xì)胞活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；16h組與4h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)給藥組比較細(xì)胞活性顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示db-cAMP對(duì)缺血缺氧后PC12細(xì)胞4h內(nèi)給藥有保護(hù)作用。 總結(jié) 1.OGD損傷后給予外源性db-cAMP可顯著增加細(xì)胞的活性和減少凋亡率,提示外源性db-cAMP對(duì)缺氧缺血損傷細(xì)胞有保護(hù)作用。 2.氨茶堿單獨(dú)用藥不能顯著提高細(xì)胞活性和減小凋亡率,提示缺氧缺血損傷后細(xì)胞內(nèi)c-AMP呈低水平狀態(tài)時(shí),單獨(dú)使用氨茶堿對(duì)缺氧缺血損傷細(xì)胞的保護(hù)作用有限。 3.研究發(fā)現(xiàn)將較小劑量氨茶堿和較小劑量的db-cAMP聯(lián)合使用能達(dá)到單獨(dú)使用較大劑量db-cAMP相同的保護(hù)作用,提示在有效地提高cAMP水平的基礎(chǔ)上,小劑量氨茶堿可發(fā)揮輔佐cAMP藥物抗細(xì)胞死亡與凋亡的協(xié)同效應(yīng)。 4.在缺氧缺糖損傷后4h內(nèi)使用db-cAMP可有效地提高細(xì)胞活性,8h后使用無明顯效果,這為臨床用藥時(shí)機(jī)的選擇,早期干預(yù)治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 5.發(fā)現(xiàn)鈣離子內(nèi)流和caspase-3凋亡酶可能參與了OGD后PC12細(xì)胞損傷機(jī)制；db-cAMP組和聯(lián)合用藥組可以阻止細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流,但不能使caspase-3凋亡酶活性明顯降低,db-cAMP抗凋亡機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R722.1
【圖文】：

碩士學(xué)位論文結(jié)果葡萄糖剝奪誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活性降低和凋亡增加!}二常PC12細(xì)胞顯微鏡下形態(tài)和染色見圖1和圖2。()GD后部分l”!’二和凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞核聚集。)目MTT比色法檢測染料11〔。eChst33342進(jìn)行染色，與正常對(duì)照組相比，O(;D后細(xì)胞嘆，細(xì)胞凋亡率升高31.57嘆。

db一eAMPI、10一 5mol[L4.氨茶堿和db一cAMP單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率的影響氨茶堿和db一cAMP單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率的影響見圖7、8和表5.。各組間比較有顯著差異(F=24.40， P=0.000)。凋亡細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光。氨茶堿組與未用藥組比較細(xì)胞凋亡率無顯著降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.194);db一cAMP組和聯(lián)合用藥組與未用藥組比較，細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.004， P=0.002)，兩組比較細(xì)胞凋亡率無明顯差異(P>0.824);聯(lián)合用藥組與氨茶堿組比較細(xì)胞凋亡率降低有明顯差異(P<0.05);OGD各組與正常對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率升高有顯著差異(P=0.000)。

DE茶堿和dbCAMP單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)PC12染色形態(tài)的影響(ffectsofsingleoreombinedadministeationofdb一cAMPandamPC12cellsonHoechst33342stalning(Origlnal火100magnlficalgrouP，B:untreatedgrouP，C:aminoPhyllinegrouP，Deombinedadministeatlonofdb一cAMPandamlnoPhylllnegro

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2743736