發(fā)布時間：2020-06-15 01:57

【摘要】： 新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxia ischemia brain damage,HIBD)是造成小兒中樞神經系統(tǒng)損害的重要原因，其發(fā)病機制尚不完全清楚且無特效治療措施。因此積極地闡明HIBD發(fā)病機制及尋找積極有效的治療措施成為國內外共同關注的課題。新近研究發(fā)現，神經元凋亡在HIBD的發(fā)病機制中占有重要地位，其中，一組半胱氨酸蛋白酶即Caspase在凋亡的發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用。IAPs(inhibitor of apoptosis)家族是哺乳動物體內唯一的內源性凋亡抑制劑家族，其中X—連鎖的凋亡抑制劑(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)不但能抑制調控Caspase(Caspase-9)的活化，還能抑制效應Caspase(Caspase-3、-7)的活化，因而具有全面抗凋亡作用。國內外尚未見有關XIAP對新生鼠HIBD的保護作用的研究。本研究采用XIAP轉基因新生小鼠在缺氧缺血后以腦損傷神經病理學評分、腦組織丟失體積、腦梗塞體積、腦萎縮體積、腦損傷程度肉眼積分、腦內Caspases活性等作為觀測指標，探討XIAP過度表達對HIBD的保護作用及其機制。 對象： (1) XIAP過度表達組(XIAP組)：新生9日齡XIAP過度表達轉基因C_(57)BL／6型小鼠79只，不拘性別，隨機又分為缺氧缺血(Hypoxia Ischemia,HI)后3h組12只；24h組12只；72h組11只；5d組26只。生后9d及12d正常對照組各9只。 (2) 野生型組(Wt組)：同期新生9日齡野生型C_(57)BL／6小鼠82只，不拘性別，隨機又分為HI后3h組11只；24h組10只；72h組9只；5d組31只； 2003年碩士研究生畢業(yè)論文 X一染色體連鎖的凋亡抑制劑(x IAP)對新生鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用 生后gd及12d正常對照組分別為11只和10只。各組動物在體重、性別、年齡 等方面均無顯著差異。 方法: (1)新生鼠HIBD模型制做:9日齡新生小鼠經3一4%氟烷吸入麻醉后， 解剖顯微鏡下結扎左側頸總動脈，于手術記時Zh后吸入9.9%氧氣60min，對 照組動物既不手術也不缺氧。 (2)微管相關蛋白一2(MAPZ)免疫組化染色:Hl后5d，副醛經心臟灌注 處死動物，取出腦組織固定后，常規(guī)脫水包埋，切片、片厚5林m。每50張取一 張，ABC法進行MAP:免疫組化染色。 (3)C哪ases活性測定:9日齡新生小鼠Hl后3h、24h、72h及gd、1 Zd 正常對照斷頭取腦分離出左右大腦皮層，手工勻漿，4℃92009離心1 smin，上 清液為胞漿成份用于casPases的活性測定。 (4)XIAP和XIAP相關因子一l(Xl砂一assoeiated factor一l，XAF一l)免疫熒 光染色:觀察XIAP與XAF一1在神經細胞中的的分布及相互關系。 (5)研陌stemblot:測定腦組織XIAP蛋白表達變化。 (6)腦梗塞體積的測量:將M妙2免疫組化切片(每50張取l張，片厚 扣m)利用Micro Image軟件測量每張切片MAPZ陰性區(qū)域面積及陽性區(qū)域面積， 利用公式計算梗塞體積。 (7)腦損傷神經病理學評分:結合MAP:免疫組化染色和常規(guī)HE染色， 依據神經病理學評分標準對腦組織損傷程度進行評分。 (8)統(tǒng)計學處理:所有結果均以X士SD表示，均數的比較采用非配對t 檢驗。P0.05為差異顯著，統(tǒng)計數據利用statView軟件運行。 結果: (1) WestemBfot結果顯示，XIAP表現為57kDa的單一條帶，半定量分析 發(fā)現XIAP表達在轉基因組明顯高于野生型組。 (2)HI后sd，XIAP過度表達小鼠腦損傷神經病理學評分在皮層、海馬、 紋狀體、丘腦各部位均較野生型小鼠明顯降低，其下降程度分別為皮層29.9% (P0.0001)，海馬19，2%(P0.001)，紋狀體13.5%(P=0.003)，丘腦10.3%(P=0.035)。 2003年碩士研究生畢業(yè)論文 X一染色體連鎖的凋亡抑制劑(xIAP)對新生鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用 (3)Hl后sd，XIAP組腦損傷程度肉眼積分、腦組織丟失體積、萎縮體積 及腦梗塞體積均明顯小于野生組(P0.0001，P0.0001，P0.0001，P0.05)。 (4)Hl后野生組Caspase一3活性在3h即明顯升高(p0.0004)，24h達到峰 值(p0.0001)，在72h仍明顯高于正常對照組。XIAp組Ca印ase一3活吐在Hl 后24h較正常對照組明顯增加(P0.0001)，但在Hl后3h及72h與正常對照組 相比無差異。Hl后各時間點CasPase一3活性升高程度在兩組中存在明顯差別，野 生組升高更為顯著。 (5)Hl后24h，XIAp組Caspase一9活勝明顯低于野生組(p=0.0008)。 (6) XIAP與XAF一1免疫熒光雙染色顯示，X認P分布在胞漿，XAF一1 分布在細胞核，XIAP與XAF一1共同陽性的細胞表現為核濃縮。 結論: (l)轉基因后XIAP過度表達的小鼠在Hl后腦組織神經病理學積分、腦組 織丟失體積、梗塞體積、萎縮體積、損傷程度肉眼積分均低于野生組，說明XIAP 對HIBD有保護作用。 (2) XIAP過度表達導致Hl后Caspases活性受到抑制，說明XIAP通過抑 制Caspases活性而起到腦保護作用。 (3)HI后部分XIAP與XAF一1雙標記的細胞表現為核濃縮，呈現凋亡的核 形態(tài)改變，表明XIAP的抗凋亡作用還存在著某些負調節(jié)機制。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R722.121

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本文編號：2713712