【摘要】：目的:Prkaa2、Ets-1廣泛存在于各種細胞中并參與多種生理和病理過程。研究顯示,Prkaa2、Ets-1均可通過多種機制參與腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展等生物過程,但沒有涉及二者之間可能存在的聯(lián)系。因此本實驗通過檢測Prkaa2和Ets-1在發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的腎小管上皮細胞的表達情況,探討Prkaa2和Ets-1作為腎臟纖維化防治的新靶點的可行性。研究方法:1、HK-2、NRK-52E細胞培養(yǎng)對照組為HK-2、NRK-52E細胞,均購自遼寧佰昊生物科技有限公司,未經(jīng)任何處理。實驗組一HK-2、NRK-52E細胞均加入TGF-β1誘導纖維化;實驗組二HK-2、NRK-52E細胞均轉(zhuǎn)染陰性對照病毒,并加入TGF-β1誘導纖維化;實驗組三HK-2、NRK-52E細胞均轉(zhuǎn)染Prkaa2低表達慢病毒,同樣加入TGF-β1誘導纖維化。實驗組細胞均在病毒轉(zhuǎn)染成功后,再加入TGF-β1誘導纖維化,培養(yǎng)方法同對照組。2、q RT-PCR、細胞爬片及細胞免疫熒光染色及Western blot采用以上三種方法檢測對照組、實驗組一、實驗組二及實驗組三HK-2、NRK-52E細胞中Prkaa2和Ets-1的表達情況。3、統(tǒng)計分析所有的實驗數(shù)據(jù)均以均值±標準差來表示,應用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,采用2-△△ct法分析目的基因m RNA相對表達量變化,觀察各組細胞目的基因表達量的變化趨勢。結(jié)果:1、對照組及實驗組HK-2、NRK-52E細胞培養(yǎng)在HK-2、NRK-52E傳代后4小時,細胞貼壁約80%時,進行病毒轉(zhuǎn)染,體外培養(yǎng)72小時后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率達90%以上,實驗組同時加入TGF-β1誘導纖維化。24小時后觀察細胞形態(tài)由圓形、多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形。2、q RT-PCR、免疫熒光染色及Western blot檢測各組HK-2、NRK-52E中Prkaa2和Ets-1的表達情況通過對Prkaa2和Ets-1蛋白及m RNA的定性及定量檢測,發(fā)現(xiàn)與正常對照組同時間點相比,實驗組一HK-2、NRK-52E細胞中Prkaa2和Ets-1表達上調(diào),并且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與實驗組二同時間點相比,實驗組三HK-2、NRK-52E細胞中Prkaa2和Ets-1表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:在TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞纖維化過程中,Prkaa2和Ets-1表達量明顯上調(diào),沉默Prkaa2基因后Ets-1表達也隨之下調(diào),HK-2、NRK-52E細胞的纖維化程度有所改善,Prkaa2和Ets-1有望成為腎臟纖維化防治的新靶點。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R726.9
【圖文】：

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3 實驗結(jié)果3.1 顯著性差異基因的生物信息分析圖 1 中 ERK/MAPK 通路被顯著抑制，紅色代表該基因在實驗結(jié)果中表現(xiàn)為顯著上調(diào)，綠色代表該基因在實驗結(jié)果中表現(xiàn)為顯著下調(diào)。該圖直觀地展示了實驗結(jié)果中 Ets-1mRNA 在 ERK/MAPK 通路中的表達顯著下調(diào)。

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3.3 免疫熒光染色結(jié)果3.3.1 HK-2、NRK-52E 細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化鑒定，TGF-β1 可誘導腎小管上皮細胞發(fā)生形態(tài)學改變，由典型的圓形、多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮�，提�?MET 過程。正常對照組細胞形態(tài)大多趨于圓形、多邊形，TGF-β1 誘導組細胞形態(tài)更趨于梭形（圖2）。TGF-β1 可誘導腎小管上皮細胞的胞漿內(nèi)幾乎都有間質(zhì)細胞的特征性表型蛋白α-SMA 和 Vimentin 的表達，說明發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（圖 3，圖 4）。

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本文編號：2712949