【摘要】： 背景 新生兒圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是新生兒期常見的臨床疾病,是導(dǎo)致新生兒發(fā)病、死亡和遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的重要因素,由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,迄今為止對(duì)其損傷后的治療仍無(wú)根本性有力措施。因此,對(duì)HIBD發(fā)病機(jī)制及其治療的進(jìn)一步研究,是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外尤為關(guān)注的圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)。近年來,隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)其發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究,治療上也相繼出現(xiàn)了新途徑。 托吡酯(TPM)作為一種新型抗癲癇藥,目前正廣泛用于臨床。隨著對(duì)托吡酯研究的不斷深入,其對(duì)窒息后腦損傷的保護(hù)作用已經(jīng)得到證實(shí)。2006年Noh MR等人通過動(dòng)物試驗(yàn)研究認(rèn)為托吡酯腦保護(hù)作用機(jī)制主要有以下幾點(diǎn)1.阻斷電壓依賴性Na~(2+)或/和Ca~(2+)通道2.激活GABA引發(fā)的Cl~-內(nèi)流3.阻滯KA/AMPA型谷氨酸受體的作用4.抑制碳酸酐酶的活性5.減輕線粒體損傷。國(guó)內(nèi)少數(shù)的試驗(yàn)研究結(jié)果表明:托吡酯能減輕缺氧缺血后腦組織中鈉蓄積,減輕腦水腫,減少神經(jīng)元死亡,有效抑制氧自由基的產(chǎn)生及毒性,具有良好的防治腦損害的作用。但是關(guān)于托吡酯的給藥時(shí)間、給藥劑量、給藥方式及其腦保護(hù)作用的具體機(jī)制等目前仍不明確,研究較少。 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)是TGF-β超家族的一個(gè)新亞族成員,目前已在多種神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)相關(guān)細(xì)胞的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)。作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的新成員,GDNF發(fā)揮著多效能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。越來越多的證據(jù)表明,其在改善和促進(jìn)損傷后的神經(jīng)元修復(fù)和再生中發(fā)揮著重要作用。就新生兒HIBD治療的特異性神經(jīng)保護(hù)措施方面,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一個(gè)重要部分,對(duì)其的研究正日益受到廣泛矚目。在對(duì)體外培養(yǎng)的用興奮性氨基酸建立的小腦皮質(zhì)神經(jīng)元變性損害模型實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)液中的GDNF可明顯減輕谷氨酸毒性,保護(hù)未受損細(xì)胞,促使受損細(xì)胞功能恢復(fù),使細(xì)胞死亡率降低,從而減輕小腦皮質(zhì)神經(jīng)元變性死亡,并呈正量效關(guān)系。GDNF在不同時(shí)期表達(dá)不一,另外,腦損傷后GDNF表達(dá)變化也存在一定的時(shí)序性規(guī)律。出生后7d的大鼠腦與新生兒腦發(fā)育相似,造成一過性腦缺氧缺血的條件也與HIBD類似。國(guó)內(nèi)外廣泛采用新生7日齡大鼠建立HIBD模型來進(jìn)行關(guān)于HIBD的研究。本實(shí)驗(yàn)研究亦采用此試驗(yàn)方法。 以上問題構(gòu)成本課題的設(shè)計(jì)思路和研究目的。通過建立缺氧缺血性損傷動(dòng)物模型,借助觀察腦損傷后不同時(shí)間托吡酯給藥對(duì)腦組織病理學(xué)改變、GDNF動(dòng)態(tài)表達(dá)水平等方面的影響,與對(duì)照組比較,進(jìn)一步探討托吡酯在腦保護(hù)作用中的治療時(shí)間窗及調(diào)控機(jī)制。對(duì)上述問題進(jìn)行深入研究,不僅有助于進(jìn)一步闡明托吡酯腦保護(hù)作用的治療機(jī)制,同時(shí)對(duì)托吡酯的治療時(shí)間窗也得到一定程度探討,為托吡酯治療圍產(chǎn)期HIBD的時(shí)機(jī)及作用機(jī)制提供強(qiáng)有力的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的 1.觀察新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化。 2.觀察托吡酯不同時(shí)間給藥對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠GDNF動(dòng)態(tài)表達(dá)的影響。 3.觀察托吡酯對(duì)缺氧缺血性損傷新生大鼠腦保護(hù)作用的治療時(shí)間窗。 4.進(jìn)一步探討托吡酯腦保護(hù)作用的機(jī)制。 方法 1.152只新生7日齡大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、單純?nèi)毖跞毖M、托吡酯治療組,后者根據(jù)損傷后托吡酯不同時(shí)間給藥又分成預(yù)處理組,后處理組及延遲治療組。 2.建立HIBD動(dòng)物模型。 3.給藥及處理方法 (1)托吡酯治療組:將托吡酯溶于注射用水中,配成2%溶液,首劑給藥劑量按150mg/kg經(jīng)灌胃器由口注入,以迅速達(dá)到血液峰濃度,以后每次給藥劑量均按100mg/kg;其中預(yù)處理組給藥時(shí)間為缺氧缺血前立即、缺氧缺血后立即、之后每隔12h各一次,直至第五天;后處理組缺氧缺血前不給藥,余同預(yù)處理組;延遲治療組缺氧缺血后2h一次,之后每隔12h一次至第五天,各組總給藥次數(shù)相同,均為12次,以觀察托吡酯的治療時(shí)間窗。 (2)單純?nèi)毖跞毖M和假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)給予等體積的生理鹽水。 (3)各組均在在缺氧缺血后12h、2d、3d、5d分別處死1/4的動(dòng)物(即假手術(shù)組每次處死6只,單純?nèi)毖跞毖M和托吡酯各治療組每次各8只)。 4.應(yīng)用HE染色、免疫組織化學(xué)及Western blotting等試驗(yàn)方法觀察和測(cè)定研究指標(biāo)。 結(jié)果 1.形態(tài)學(xué)結(jié)果單純?nèi)毖跞毖M同側(cè)腦組織梗塞液化發(fā)生率約90%,病理學(xué)改變包括紋狀體、海馬、皮層及下丘腦等部位出現(xiàn)組織脫失,組織蒼白、萎縮,在嚴(yán)重?fù)p傷腦區(qū)域,大部分同側(cè)半球發(fā)生液化,僅有很少的解剖標(biāo)志可辨認(rèn);延遲處理組腦組織壞死也較明顯;而預(yù)處理組及后處理組,腦損傷發(fā)生顯著減輕。 2.HE染色結(jié)果假手術(shù)組組織結(jié)構(gòu)層次明晰,細(xì)胞輪廓清楚,核居中,尼氏體位于核周邊:單純?nèi)毖跞毖M在缺氧缺血后12h缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體出現(xiàn)輕微的病理變化,第2d病變最嚴(yán)重,表現(xiàn)為皮質(zhì)、紋狀體、海馬、丘腦大片壞死區(qū),第3d病變減輕,出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生,第5d基本上未見到破裂細(xì)胞,出現(xiàn)大片膠質(zhì)瘢痕;托吡酯預(yù)處理和后處理組術(shù)后12h上述部位病變不明顯,第2d出現(xiàn)輕微病變,表現(xiàn)為極少數(shù)細(xì)胞間隙增寬,細(xì)胞核濃縮,第3d、5d未見明顯病灶;托吡酯延遲處理組腦損傷減輕不明顯。 3.免疫組織化學(xué)假手術(shù)組僅見較少的GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),稀疏地分布于整個(gè)大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬,雙側(cè)對(duì)稱,各時(shí)間點(diǎn)上檢測(cè)未見明顯的動(dòng)態(tài)變化;單純?nèi)毖跞毖M和托吡酯各治療組非缺血側(cè)GDNF陽(yáng)性細(xì)胞染色的程度、數(shù)量及變化情況均類似于假手術(shù)組;單純?nèi)毖跞毖M缺血側(cè)皮質(zhì)GDNF陽(yáng)性細(xì)胞在損傷后12h開始表達(dá),第2d進(jìn)一步上升,第3d達(dá)高峰,第5d基本恢復(fù)正常,僅見極少量的GDNF表達(dá);托吡酯預(yù)處理組和后處理組缺血側(cè)皮質(zhì)在損傷后12h即可見較多GDNF陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá),第2d進(jìn)一步增加,第三天達(dá)高峰,第5d有所減少,但還可見較多的表達(dá),在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均明顯高于單純?nèi)毖跞毖M(P＜0.05),染色較深;延遲處理組GDNF陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)與單純?nèi)毖跞毖M相比增加不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4.Western blotting單純?nèi)毖跞毖M與托吡酯各處理組均有GDNF蛋白表達(dá)條帶,托吡酯預(yù)處理組和后處理組蛋白表達(dá)明顯高于單純?nèi)毖跞毖M,應(yīng)用生物凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(AlphaImager 2200)掃描定量,通過計(jì)算出各組蛋白表達(dá)的相對(duì)積分值作為蛋白的相對(duì)含量,經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn):托吡酯預(yù)處理組和后處理組各時(shí)間點(diǎn)上蛋白表達(dá)均高于單純?nèi)毖跞毖M,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);且預(yù)處理組蛋白表達(dá)又高于后處理組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):而延遲處理組蛋白表達(dá)與單純?nèi)毖跞毖M相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05) 結(jié)論 1.托吡酯可以明顯減輕缺氧缺血導(dǎo)致的腦細(xì)胞水腫、液化、壞死,降低腦損傷發(fā)生率,發(fā)揮較好的腦保護(hù)作用。 2.缺氧缺血性腦損傷后GDNF表達(dá)變化存在一定的時(shí)序性規(guī)律,于損傷后第三天達(dá)最高水平,托吡酯治療可使缺氧缺血性腦損傷后GDNF表達(dá)升高。 3.托吡酯腦保護(hù)作用機(jī)制之一可能通過增加膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF實(shí)現(xiàn)。 4.托吡酯的治療時(shí)間窗較短,為缺氧缺血后2h之內(nèi),且預(yù)防性用藥(損傷前給藥)對(duì)HIBD神經(jīng)元的保護(hù)作用強(qiáng)于緊急用藥(損傷后給藥)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R722.1

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2 沈麗明;范業(yè)宏;;一氧化氮、一氧化氮合酶與腦缺血性損傷[J];黑龍江醫(yī)學(xué);2011年07期

3 張欣;丁v，

本文編號(hào)：2700158