【摘要】： 先天性心臟病(簡(jiǎn)稱先心病)是人類最常見(jiàn)的出生缺陷之一，其發(fā)病機(jī)理的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)課題，研究者試圖找出其發(fā)病的原因并加以預(yù)防，減少發(fā)病率，以提高出生人口的質(zhì)量。遺傳因素日漸受到重視，某些控制心臟發(fā)育基因的突變或功能缺陷可能是先心病的分子基礎(chǔ)。其中，連接蛋白43(Connexin43，Cx43)基因作為先心病的重要候選基因之一正被日益關(guān)注。Cx43是哺乳動(dòng)物心臟中最主要的連接蛋白，其在細(xì)胞膜上聚合而成的縫隙連接通道是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間離子、小分子代謝物和信號(hào)分子跨膜交流的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近年來(lái)一系列動(dòng)物模型的研究提示Cx43在心臟形態(tài)發(fā)育中具有重要作用，Cx43基因缺陷或過(guò)量表達(dá)均可導(dǎo)致以右室流出道肥厚梗阻為主的心臟畸形。但目前關(guān)于人類先心病與Cx43基因異常之間關(guān)系的研究還非常有限，Cx43基因在先心病發(fā)病中所起的作用迄今還未有明確的結(jié)論。本研究通過(guò)Cx43基因敲除(Cx43KO)小鼠，觀察其胚胎期的心臟發(fā)育及其可能的病理機(jī)制。同時(shí)，對(duì)漢族先心病患者進(jìn)行一個(gè)大樣本的Cx43基因突變檢測(cè)的研究，較全面地觀察Cx43基因突變是否與先心病發(fā)病相關(guān)，并檢測(cè)先心病患者心肌Cx43基因的表達(dá)，為闡述先心病的病理機(jī)制提供有價(jià)值的資料。 第一部分Cx43基因敲除小鼠心臟表型及相關(guān)基因的表達(dá) 研究目的 觀察Cx43基因敲除(Cx43KO)小鼠心臟異常發(fā)育的表型及其胚胎期心臟中Cx40和Cx45的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，探討其發(fā)生心臟畸形的可能機(jī)制。 材料和方法 2月齡Cx43KO雜合小鼠交配，選用其后代胚胎期(embryonic day，ED)13.5天至出生后1天小鼠作為研究對(duì)象，采用PCR方法鑒定基因型。根據(jù)基因型分為Cx43KO純合子(Cx43-／-)、雜合子(Cx43+／-)及野生型(Cx43+／+)；C57BL6小鼠作為對(duì)照組。小鼠進(jìn)行顯微解剖觀察心臟大體結(jié)構(gòu)，心臟組織切片，HE染色觀察心臟形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。同時(shí)選取ED10.5～15.5的Cx43KO純合子及野生型小鼠胚胎，免疫組化ABC法檢測(cè)Cx40、Cx45在心臟的時(shí)空表達(dá)，SCIM顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。 結(jié)果 1．Cx43KO新生小鼠在解剖顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：純合型Cx43KO小鼠心臟主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈近右室流出道端明顯膨隆突出；而野生型、雜合型和C57BL6小鼠心臟大體結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常。 2．心臟切片HE染色顯示：胚胎期及新生純合型Cx43KO小鼠心臟主要表現(xiàn)為右室流出道明顯梗阻；野生型、雜合型和C57BL6小鼠心臟形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常。 3．野生型小鼠胚胎心臟Cx40從ED11.5開(kāi)始在右室表達(dá)，隨后逐漸分布于各房室，ED14.5后在心室的表達(dá)開(kāi)始減弱，出生后主要分布于心房、希氏束及浦氏纖維；Cx45在ED10.5表達(dá)于心臟流入道、流出道心肌及房室墊，但隨后表達(dá)開(kāi)始下調(diào)，僅在流出道繼續(xù)表達(dá)，成年后主要在室間隔部分表達(dá)。Cx43KO小鼠Cx40和Cx45的時(shí)空表達(dá)在ED10.5～15.5這一心臟分隔、瓣膜發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期卻較野生型明顯減弱(P＜0.05)。 結(jié)論 1．Cx43KO小鼠存在明顯的心臟發(fā)育異常，主要表現(xiàn)為右室流出道梗阻。 2．Cx43KO小鼠心臟發(fā)育過(guò)程中Cx40和Cx45時(shí)空表達(dá)出現(xiàn)異常，這可能是其發(fā)生心臟畸形的相關(guān)的潛在機(jī)制。 第二部分Cx43基因在先天性心臟病中的突變檢測(cè) 研究目的 檢測(cè)先心病患者中Cx43基因的突變，觀察Cx43基因突變與人類先心病的關(guān)系，為闡述先心病的病因提供有價(jià)值的資料。 材料和方法 研究對(duì)象包括試驗(yàn)組250例不同類型的先心病患者，40例健康兒童為對(duì)照組。試驗(yàn)組分成復(fù)雜先心病和簡(jiǎn)單先心病兩個(gè)亞組：復(fù)雜先心病182例，主要以心臟圓錐動(dòng)脈干畸形為主；68例簡(jiǎn)單先心病包括室間隔缺損(VSD)、房間隔缺損(ASD)、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(PDA)和肺動(dòng)脈狹窄(PS)�；蚪MDNA全部從外周血提取，同時(shí)亦從心臟手術(shù)中收集部分先心病患者的右室流出道心肌中提取DNA，與外周血相對(duì)照。在Cx43編碼序列兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物(F1和R3)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1348bp。其中上游引物設(shè)計(jì)在內(nèi)含子中，以避免基因組中Cx43假基因的非特異擴(kuò)增。同時(shí)在編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)4條引物(R1、F2、R2和F3)，并與2條外側(cè)引物一起配成3對(duì)作為測(cè)序引物。PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行DNA直接測(cè)序。 結(jié)果 1．所有標(biāo)本均成功由PCR擴(kuò)增出Cx43基因的全長(zhǎng)編碼序列，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1348bp，與所設(shè)計(jì)的片段大小預(yù)期值符合，特異性理想。 2．所有研究對(duì)象的Cx43基因測(cè)序后同GenBank人類Cx43編碼序列進(jìn)行比較，僅有1例患者(法洛四聯(lián)癥)存在1個(gè)單核苷酸的多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)，為924位核苷酸G→A。其余研究對(duì)象的測(cè)序結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)Cx43基因突變。 結(jié)論 1．人類先心病中Cx43基因編碼區(qū)可能不存在規(guī)律性的基因位點(diǎn)突變。 2．Cx43基因外顯子的突變?cè)谙刃牟≈锌赡芎苌僖?jiàn)，進(jìn)一步說(shuō)明人類心臟的發(fā)育是一個(gè)涉及多基因、多環(huán)節(jié)、多因子的精細(xì)復(fù)雜的過(guò)程，Cx43基因參與人類先心病的發(fā)病需要更深入的研究。 第三部分Cx43基因在法洛四聯(lián)癥心肌中表達(dá)的研究 研究目的 檢測(cè)法洛四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot，TOF)患者心肌Cx43基因的表達(dá)。為解釋Cx43基因與某些先心病的關(guān)系提供證據(jù)。 材料和方法 試驗(yàn)組為16例TOF的右室流出道心肌，4例單純VSD和1例原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者的右室流出道心肌為對(duì)照，通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)Cx43 mRNA的表達(dá)差異，SCIM顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)灰度值進(jìn)行半定量分析。進(jìn)一步對(duì)心肌切片行免疫組化ABC法，觀察心肌細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 1．與對(duì)照相比，TOF患者Cx43基因表達(dá)水平明顯增高。從Cx43／β-actin的比值可見(jiàn)，TOF患者Cx43基因mRNA水平顯著高于對(duì)照(P＜0.01)。 2．免疫組化提示TOF右室心肌細(xì)胞具有較高的Cx43表達(dá)，而對(duì)照心肌則未見(jiàn)明顯的Cx43表達(dá)。 結(jié)論 1．TOF右室流出道心肌Cx43的高表達(dá)提示胚胎期心臟發(fā)育過(guò)程中可能存在Cx43時(shí)空表達(dá)紊亂。 2．Cx43基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的異常可能影響相關(guān)心臟發(fā)育因子的調(diào)控作用，從而導(dǎo)致參與心臟發(fā)育基因表達(dá)紊亂，這可能是TOF發(fā)病的一種潛在機(jī)制。 3．TOF作為人類最常見(jiàn)的先天性圓錐動(dòng)脈干畸形，其心肌Cx43基因的異常表達(dá)為探討Cx43基因功能缺陷導(dǎo)致先心病提供了新的線索。 總結(jié) Cx43KO小鼠存在心臟畸形和Cx40、Cx45基因表達(dá)異常，表明Cx43基因與心臟發(fā)育密切相關(guān)，提示其在心臟發(fā)育過(guò)程中存在精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制。就人類而言，大多數(shù)先心病患者中可能不存在規(guī)律性的Cx43基因突變，提示Cx43基因突變引起先心病并不多見(jiàn)，Cx43基因可能是心臟發(fā)育中的重要環(huán)節(jié)之一；TOF心肌Cx43基因的異常表達(dá)提示其功能缺陷對(duì)先心病發(fā)病所起的作用。人類心臟的發(fā)育是一個(gè)多基因、多信號(hào)和多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜過(guò)程，Cx43基因異�？赡軐�(dǎo)致這一過(guò)程出現(xiàn)紊亂，同時(shí)引起相關(guān)心臟發(fā)育因子的異常，從而導(dǎo)致先心病的發(fā)生。因此揭示Cx43與其它相關(guān)基因在心臟發(fā)育中相互作用及調(diào)控機(jī)制需要更深入的研究。
【圖文】：

存在顯著的右室流出道圓錐部異常膨隆，多形成左右2個(gè)突起部分;右心室肥厚，左心室有時(shí)可見(jiàn)不同程度縮小;多有左、右心房擴(kuò)張;而野生型、雜合型和C57BL6新生小鼠心臟大體結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常(圖1一3)。圖1一3新生小鼠心臟大體解剖圖A:C57BL6/SJ新生小鼠心臟;B:Cx43一八新生小鼠心臟，見(jiàn)顯著的右室流出道圓錐部異常膨隆(箭頭處)，右心室肥厚，左心室可見(jiàn)輕度后移，左、右心房明顯擴(kuò)張;注:RV右心室;LV左心室;P肺動(dòng)脈;RA右心房;LA左心房。

圖1一5新生小鼠心臟切片HE染色A:Cx43一小鼠心臟的矢狀切面，，示右室流出道有明顯的肌性梗阻;C:對(duì)照組，右室流出道通暢;B:Cx43一小鼠心臟的冠狀切面，示室間隔異常肥厚;D:對(duì)照組，心臟各腔室大小正常。注:PA肺動(dòng)脈;AO主動(dòng)脈;RV右心室;1刃左心室;IVS室間隔RVOT右室流出道;RVOTO右室流出道梗阻。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R725.4

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