發(fā)布時間：2020-06-01 22:17

【摘要】： 先天性心臟病(簡稱先心病)是人類最常見的出生缺陷之一，其發(fā)病機理的研究已經(jīng)成為熱點課題，研究者試圖找出其發(fā)病的原因并加以預(yù)防，減少發(fā)病率，以提高出生人口的質(zhì)量。遺傳因素日漸受到重視，某些控制心臟發(fā)育基因的突變或功能缺陷可能是先心病的分子基礎(chǔ)。其中，連接蛋白43(Connexin43，Cx43)基因作為先心病的重要候選基因之一正被日益關(guān)注。Cx43是哺乳動物心臟中最主要的連接蛋白，其在細胞膜上聚合而成的縫隙連接通道是介導(dǎo)相鄰細胞間離子、小分子代謝物和信號分子跨膜交流的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近年來一系列動物模型的研究提示Cx43在心臟形態(tài)發(fā)育中具有重要作用，Cx43基因缺陷或過量表達均可導(dǎo)致以右室流出道肥厚梗阻為主的心臟畸形。但目前關(guān)于人類先心病與Cx43基因異常之間關(guān)系的研究還非常有限，Cx43基因在先心病發(fā)病中所起的作用迄今還未有明確的結(jié)論。本研究通過Cx43基因敲除(Cx43KO)小鼠，觀察其胚胎期的心臟發(fā)育及其可能的病理機制。同時，對漢族先心病患者進行一個大樣本的Cx43基因突變檢測的研究，較全面地觀察Cx43基因突變是否與先心病發(fā)病相關(guān)，并檢測先心病患者心肌Cx43基因的表達，為闡述先心病的病理機制提供有價值的資料。 第一部分Cx43基因敲除小鼠心臟表型及相關(guān)基因的表達 研究目的 觀察Cx43基因敲除(Cx43KO)小鼠心臟異常發(fā)育的表型及其胚胎期心臟中Cx40和Cx45的時空表達規(guī)律，探討其發(fā)生心臟畸形的可能機制。 材料和方法 2月齡Cx43KO雜合小鼠交配，選用其后代胚胎期(embryonic day，ED)13.5天至出生后1天小鼠作為研究對象，采用PCR方法鑒定基因型。根據(jù)基因型分為Cx43KO純合子(Cx43-／-)、雜合子(Cx43+／-)及野生型(Cx43+／+)；C57BL6小鼠作為對照組。小鼠進行顯微解剖觀察心臟大體結(jié)構(gòu)，心臟組織切片，HE染色觀察心臟形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。同時選取ED10.5～15.5的Cx43KO純合子及野生型小鼠胚胎，免疫組化ABC法檢測Cx40、Cx45在心臟的時空表達，SCIM顯微圖像分析系統(tǒng)對染色強度進行定量分析。 結(jié)果 1．Cx43KO新生小鼠在解剖顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：純合型Cx43KO小鼠心臟主要表現(xiàn)為肺動脈近右室流出道端明顯膨隆突出；而野生型、雜合型和C57BL6小鼠心臟大體結(jié)構(gòu)未見異常。 2．心臟切片HE染色顯示：胚胎期及新生純合型Cx43KO小鼠心臟主要表現(xiàn)為右室流出道明顯梗阻；野生型、雜合型和C57BL6小鼠心臟形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)未見異常。 3．野生型小鼠胚胎心臟Cx40從ED11.5開始在右室表達，隨后逐漸分布于各房室，ED14.5后在心室的表達開始減弱，出生后主要分布于心房、希氏束及浦氏纖維；Cx45在ED10.5表達于心臟流入道、流出道心肌及房室墊，但隨后表達開始下調(diào)，僅在流出道繼續(xù)表達，成年后主要在室間隔部分表達。Cx43KO小鼠Cx40和Cx45的時空表達在ED10.5～15.5這一心臟分隔、瓣膜發(fā)育的關(guān)鍵時期卻較野生型明顯減弱(P＜0.05)。 結(jié)論 1．Cx43KO小鼠存在明顯的心臟發(fā)育異常，主要表現(xiàn)為右室流出道梗阻。 2．Cx43KO小鼠心臟發(fā)育過程中Cx40和Cx45時空表達出現(xiàn)異常，這可能是其發(fā)生心臟畸形的相關(guān)的潛在機制。 第二部分Cx43基因在先天性心臟病中的突變檢測 研究目的 檢測先心病患者中Cx43基因的突變，觀察Cx43基因突變與人類先心病的關(guān)系，為闡述先心病的病因提供有價值的資料。 材料和方法 研究對象包括試驗組250例不同類型的先心病患者，40例健康兒童為對照組。試驗組分成復(fù)雜先心病和簡單先心病兩個亞組：復(fù)雜先心病182例，主要以心臟圓錐動脈干畸形為主；68例簡單先心病包括室間隔缺損(VSD)、房間隔缺損(ASD)、動脈導(dǎo)管未閉(PDA)和肺動脈狹窄(PS)�；蚪MDNA全部從外周血提取，同時亦從心臟手術(shù)中收集部分先心病患者的右室流出道心肌中提取DNA，與外周血相對照。在Cx43編碼序列兩側(cè)設(shè)計一對引物(F1和R3)，擴增片段長度為1348bp。其中上游引物設(shè)計在內(nèi)含子中，以避免基因組中Cx43假基因的非特異擴增。同時在編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計4條引物(R1、F2、R2和F3)，并與2條外側(cè)引物一起配成3對作為測序引物。PCR產(chǎn)物純化后進行DNA直接測序。 結(jié)果 1．所有標本均成功由PCR擴增出Cx43基因的全長編碼序列，PCR產(chǎn)物的長度為1348bp，與所設(shè)計的片段大小預(yù)期值符合，特異性理想。 2．所有研究對象的Cx43基因測序后同GenBank人類Cx43編碼序列進行比較，僅有1例患者(法洛四聯(lián)癥)存在1個單核苷酸的多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)，為924位核苷酸G→A。其余研究對象的測序結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)Cx43基因突變。 結(jié)論 1．人類先心病中Cx43基因編碼區(qū)可能不存在規(guī)律性的基因位點突變。 2．Cx43基因外顯子的突變在先心病中可能很少見，進一步說明人類心臟的發(fā)育是一個涉及多基因、多環(huán)節(jié)、多因子的精細復(fù)雜的過程，Cx43基因參與人類先心病的發(fā)病需要更深入的研究。 第三部分Cx43基因在法洛四聯(lián)癥心肌中表達的研究 研究目的 檢測法洛四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot，TOF)患者心肌Cx43基因的表達。為解釋Cx43基因與某些先心病的關(guān)系提供證據(jù)。 材料和方法 試驗組為16例TOF的右室流出道心肌，4例單純VSD和1例原發(fā)性肺動脈高壓患者的右室流出道心肌為對照，通過RT-PCR的方法檢測Cx43 mRNA的表達差異，SCIM顯微圖像分析系統(tǒng)對灰度值進行半定量分析。進一步對心肌切片行免疫組化ABC法，觀察心肌細胞中Cx43蛋白的表達。 結(jié)果 1．與對照相比，TOF患者Cx43基因表達水平明顯增高。從Cx43／β-actin的比值可見，TOF患者Cx43基因mRNA水平顯著高于對照(P＜0.01)。 2．免疫組化提示TOF右室心肌細胞具有較高的Cx43表達，而對照心肌則未見明顯的Cx43表達。 結(jié)論 1．TOF右室流出道心肌Cx43的高表達提示胚胎期心臟發(fā)育過程中可能存在Cx43時空表達紊亂。 2．Cx43基因轉(zhuǎn)錄表達的異�？赡苡绊懴嚓P(guān)心臟發(fā)育因子的調(diào)控作用，從而導(dǎo)致參與心臟發(fā)育基因表達紊亂，這可能是TOF發(fā)病的一種潛在機制。 3．TOF作為人類最常見的先天性圓錐動脈干畸形，其心肌Cx43基因的異常表達為探討Cx43基因功能缺陷導(dǎo)致先心病提供了新的線索。 總結(jié) Cx43KO小鼠存在心臟畸形和Cx40、Cx45基因表達異常，表明Cx43基因與心臟發(fā)育密切相關(guān)，提示其在心臟發(fā)育過程中存在精細的調(diào)節(jié)機制。就人類而言，大多數(shù)先心病患者中可能不存在規(guī)律性的Cx43基因突變，提示Cx43基因突變引起先心病并不多見，Cx43基因可能是心臟發(fā)育中的重要環(huán)節(jié)之一；TOF心肌Cx43基因的異常表達提示其功能缺陷對先心病發(fā)病所起的作用。人類心臟的發(fā)育是一個多基因、多信號和多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜過程，Cx43基因異�？赡軐�(dǎo)致這一過程出現(xiàn)紊亂，同時引起相關(guān)心臟發(fā)育因子的異常，從而導(dǎo)致先心病的發(fā)生。因此揭示Cx43與其它相關(guān)基因在心臟發(fā)育中相互作用及調(diào)控機制需要更深入的研究。
【圖文】：

存在顯著的右室流出道圓錐部異常膨隆，多形成左右2個突起部分;右心室肥厚，左心室有時可見不同程度縮小;多有左、右心房擴張;而野生型、雜合型和C57BL6新生小鼠心臟大體結(jié)構(gòu)未見異常(圖1一3)。圖1一3新生小鼠心臟大體解剖圖A:C57BL6/SJ新生小鼠心臟;B:Cx43一八新生小鼠心臟，見顯著的右室流出道圓錐部異常膨隆(箭頭處)，右心室肥厚，左心室可見輕度后移，左、右心房明顯擴張;注:RV右心室;LV左心室;P肺動脈;RA右心房;LA左心房。

圖1一5新生小鼠心臟切片HE染色A:Cx43一小鼠心臟的矢狀切面，，示右室流出道有明顯的肌性梗阻;C:對照組，右室流出道通暢;B:Cx43一小鼠心臟的冠狀切面，示室間隔異常肥厚;D:對照組，心臟各腔室大小正常。注:PA肺動脈;AO主動脈;RV右心室;1刃左心室;IVS室間隔RVOT右室流出道;RVOTO右室流出道梗阻。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R725.4

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;[J];;年期

2 ;[J];;年期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會議論文 前10條

1 孫慧超;田杰;朱靜;;組蛋白低乙酰化對小鼠胚胎心臟發(fā)育的影響及其機制[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

2 羅娜;李發(fā)祥;葉湘漓;陳婷芳;黃婷;吳堅;王琨;吳秀山;鄧云;;利用斑馬魚模型研究心臟組織高表達基因HDGC3在心臟發(fā)育中的功能[A];第二屆模式生物與人類健康研討會會議論文集[C];2012年

3 王躍群;李永青;袁婺洲;朱傳柄;吳秀山;;人類心臟發(fā)育候選基因IXL的克隆和功能研究[A];湖南省生理科學(xué)會2006年度學(xué)術(shù)年會論文摘要匯編[C];2007年

4 楊雪芳;田杰;陳國珍;孫慧超;鐘立霖;吳曉云;朱靜;;p300介導(dǎo)的組蛋白乙�；揎椗c心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

5 周希;黃曉燕;褚茂平;高瞻;戴曉春;楊德業(yè);;BMPRIA基因敲除小鼠心臟發(fā)育不同階段其下游基因Pax-8的表達[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

6 楊德業(yè);周希;黃曉燕;褚茂平;高瞻;戴曉春;;Pax-8在ALK3基因敲除小鼠心臟發(fā)育不同階段中的表達[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

7 吳秀山;;Wg信號途徑新成員在心臟發(fā)育與疾病發(fā)生中的作用[A];中國遺傳學(xué)會第八次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

8 陳國珍;朱靜;田杰;張曉萍;吳剛;孫慧超;;組蛋白乙�；竝300和CBP在小鼠心臟發(fā)育中的時序表達[A];遺傳學(xué)進步與人口健康高峰論壇論文集[C];2007年

9 劉曉宇;左O;劉雯;;wnt-3a對Connexin43及相關(guān)基因的表達調(diào)控[A];中國細胞生物學(xué)學(xué)會醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2006年

10 曾燕;施靜;;神經(jīng)細胞激活控制成纖維細胞間縫隙連接通訊[A];節(jié)能環(huán)保 和諧發(fā)展——2007中國科協(xié)年會論文集（二）[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 盧蘇燕;法發(fā)現(xiàn)影響心臟發(fā)育關(guān)鍵物質(zhì)[N];新華每日電訊;2000年

2 ;法找到影響心臟發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)[N];中國中醫(yī)藥報;2000年

3 米愛;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)有利于心臟發(fā)育的蛋白質(zhì)[N];中國消費者報;2008年

4 葛秋芳;心臟中“祖細胞”：受刺激后可長成心臟新組織[N];新華每日電訊;2007年

5 實習生 周英;得不得心臟病 基因說了算？[N];科技日報;2011年

6 郭宏偉;孕期飲食切莫厚此薄彼[N];中國食品質(zhì)量報;2001年

7 常朝輝邋胡麗娟;第十次全國營養(yǎng)學(xué)術(shù)會議在京召開[N];科技日報;2008年

8 唐 文;母親體重與寶寶心臟關(guān)系密切[N];中國中醫(yī)藥報;2005年

9 力軍;不適宜7～12歲少兒的鍛煉項目[N];衛(wèi)生與生活報;2007年

10 張勤;有些先心病患兒不能手術(shù)治療[N];衛(wèi)生與生活報;2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 彭濤;小鼠心臟神經(jīng)嵴細胞的生物學(xué)特性及其相關(guān)基因研究[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

2 謝利劍;Connexin43基因與先天性心臟病發(fā)病機制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

3 王芳;溶血磷脂酸信號在出生后心臟發(fā)育中的變化及其生物學(xué)功能的探討[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

4 梁進濤;高糖對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的影響及機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

5 常在;Akt1及其異構(gòu)體在心臟發(fā)育過程中的作用研究[D];南京大學(xué);2011年

6 儀靜;SUR-8在哺乳動物胚胎心臟發(fā)育中的功能研究及其在其他系統(tǒng)中的功能初探[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

7 陳紅娟;阿托伐他汀抑制自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚心肌縫隙連接蛋白43重構(gòu)的實驗研究[D];浙江大學(xué);2007年

8 許文燦;高血糖促心臟連接蛋白43磷酸化及其對連接通道功能的影響[D];汕頭大學(xué);2008年

9 章宏;溶血磷脂酸對心梗過程中的免疫炎癥反應(yīng)及連接蛋白43的調(diào)控[D];吉林大學(xué);2009年

10 陳莉;斑馬魚Slitl2基因的克隆，表達及初步功能研究和斑馬魚Dec1,Dec2基因?qū)π呐K發(fā)育影響的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 羅開梅;人類心臟發(fā)育相關(guān)新基因的克隆及其表達研究[D];湖南師范大學(xué);2003年

2 楊雪芳;p300介導(dǎo)乙�；揎椗c心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

3 林吉進;急性心肌缺血時連接蛋白43的改變及對心臟電生理特性的影響[D];汕頭大學(xué);2001年

4 戴琦;篩選控制果蠅心臟發(fā)育的基因[D];湖南師范大學(xué);2001年

5 鄭繼翠;縫隙連接蛋白43在正常結(jié)腸及先天性巨結(jié)腸腸壁中的分布[D];青島大學(xué);2003年

6 李寧;人類心臟發(fā)育候選基因AHNAKβ的表達與功能研究[D];湖南師范大學(xué);2008年

7 劉輝;人類心臟表達新基因ZNF411和ZNF415的克隆與功能研究[D];湖南師范大學(xué);2004年

8 丁杰;間隙連接蛋白CX43在卵巢腫瘤中的初步研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2003年

9 周亮;人類鋅指蛋白新基因的研究[D];湖南師范大學(xué);2003年

10 劉學(xué)慶;小鼠胚胎發(fā)育不同時期心臟差異蛋白質(zhì)組分析[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2005年

本文編號：2692151