【摘要】： PART I:重慶地區(qū)兒童偏肺病毒感染狀況調(diào)查 目的:檢測重慶地區(qū)兒童人類偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)特異性IgG抗體,了解不同年齡兒童該病毒感染狀況。 方法:由于hMPV與兒童最常見的呼吸道病毒病原——呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus , RSV)同屬副粘病毒科,需首先明確hMPV與RSV有否交叉抗原。采用RSV抗原吸附血清標(biāo)本中可能存在的RSV抗體,用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)法比較未經(jīng)吸附和已吸附RSV抗體的血清與RSV或hMPV感染細(xì)胞裂解液的反應(yīng)情況;制備抗hMPV兔血清,用免疫印跡法檢測該血清與hMPV和RSV反應(yīng)性,進一步排除RSV和hMPV之間存在交叉抗原的可能性。然后用hMPV感染的Vero-E6細(xì)胞裂解液為抗原,用ELISA法檢測325份0-6歲非呼吸道感染患兒和正常兒童的血清標(biāo)本中hMPV IgG抗體。 結(jié)果:經(jīng)RSV抗原吸附的血清與RSV抗原反應(yīng)性明顯降低,同一血清與hMPV的反應(yīng)性卻無明顯改變;免疫印跡法證實,用hMPV抗原免疫家兔獲得的抗hMPV抗血清僅與hMPV抗原反應(yīng),而不與RSV抗原反應(yīng),提示RSV與hMPV間并無交叉抗原性。用ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)0-6歲兒童hMPV抗體平均陽性率為78.8%。而不同年齡組兒童血清中hMPV IgG抗體陽性率分別為:0-5月組為74.5%,6-11月組為64%,12-23月、24-35月、3-6歲組分別為72.7%、90.3%、93.1%。在各年齡組中RSV與hMPV陽性率非常相近。 結(jié)論:hMPV是重慶地區(qū)兒童常見的呼吸道病毒病原,既往感染率與RSV相似,至6歲時兒童幾乎均經(jīng)歷過hMPV感染。 PART II:重慶地區(qū)兒童血清人類偏肺病毒中和活性初步研究 目的:體液免疫中的重要組成部分中和抗體可以阻止病毒的吸附,在預(yù)防呼吸道疾病的發(fā)生和疾病的恢復(fù)中起重要作用。hMPV已被證實為我國兒童重要的呼吸道病毒病原之一,本研究擬初步分析重慶地區(qū)0-6歲兒童血清hMPV中和活性及與hMPV IgG抗體水平的關(guān)系,為進一步大樣本的血清流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 方法:0-35月齡兒童血清來自因外科疾患住院的兒童,3-6歲兒童血清來自托幼兒童體檢血清,共50份血清標(biāo)本。采用微量中和實驗檢測上述血清中hMPV中和活性,分析血清中和活性水平及其與hMPV IgG抗體水平的相關(guān)性。 結(jié)果:在抽取的50份血清標(biāo)本中,此前通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測為陰性的8份標(biāo)本均未顯示中和活性,而42份hMPV IgG抗體陽性血清標(biāo)本中和活性均顯示陽性,平均中和滴度為1:129。其中0-5月組中和滴度均值為1:160,6-11月、12-23月、24-35月、3-6歲組中和滴度均值分別為1:58.9、1:114.9、1:172.8、1:160。血清中抗hMPV IgG抗體水平和中和活性具有顯著相關(guān)性,r=0.668,但hMPV IgG水平與中和活性并不平行。 結(jié)論:0-6歲兒童血清中多具有hMPV中和活性,但其是否足以預(yù)防不同亞型hMPV感染尚待進一步研究。 PART III:人類偏肺病毒融合蛋白基因的克隆和真核表達(dá) 目的:融合蛋白(fusion protein, F)是病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白,其可以刺激機體產(chǎn)生保護性抗體,故在致病機制中扮演重要的角色。因此我們選擇構(gòu)建hMPV F基因的真核表達(dá)質(zhì)粒,并通過在昆蟲細(xì)胞sf-9中表達(dá)從而獲得具有正確空間結(jié)構(gòu)及抗原性的重組F蛋白,為今后研發(fā)血清學(xué)診斷試劑、以及制備單克隆抗體與疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法:采用RT-PCR法擴增人類偏肺病毒A亞型F基因的全長序列,將序列片段插入供體質(zhì)粒pFastBacHT載體多克隆位點區(qū),經(jīng)酶切鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac,供體質(zhì)粒與受體桿粒(Bacmid)發(fā)生位點特異性轉(zhuǎn)座獲得重組的桿粒。采用脂質(zhì)體將重組桿粒轉(zhuǎn)染進昆蟲細(xì)胞sf-9,包裝獲得感染性桿狀病毒。用此病毒感染sf-9細(xì)胞并表達(dá)蛋白,經(jīng)可結(jié)合6×His Tag的樹脂純化后用免疫印跡法驗證表達(dá)蛋白。 結(jié)果:PCR及序列分析證實所獲得的重組桿粒包含hMPV全長F基因序列,被重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞sf-9顯示典型細(xì)胞病變效應(yīng)。采用抗6×His單克隆抗體為一抗,免疫印跡法檢測到分子量約70KDa的較單一的蛋白條帶,證實F蛋白表達(dá)成功。 結(jié)論:桿狀病毒是一高通量、目標(biāo)蛋白抗原性保存完好的表達(dá)系統(tǒng)。采用這一系統(tǒng)成功表達(dá)的hMPV F蛋白,將為hMPV血清流行病學(xué)研究、免疫發(fā)病機理研究和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 hMPV 感染 Vero-E6 細(xì)胞病變Figure 1-1 Cytopathic effects on Vero-E6 cells caused by hMPVA:mock Vero-E6 cells(×100)；B,C,:hMPV infected Vero-E6 cells with obvisous CPE(×100) D:hMPV infected Vero-E6 cells with obvisous CPE(×200)hMPV were inoculated onto Vero-E6 cells. CPE of focal changes, increased granulars, celldestruction and subsequent detachment appeared at days 5 post inoculation.3.2RT-PCR用 Trizol 試劑提取 Vero-E6 細(xì)胞總 RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后，，擴增 hMPV基因組中 F 基因片段，同時以未感染病毒的 Vero-E6 細(xì)胞組作為陰性對照。PCR產(chǎn)物凝膠電泳后顯示目的條帶，F(xiàn) 基因產(chǎn)物 450bp，陰性對照無條帶（圖 1-2）。

1 2 3 4圖 1-2 hMPV F 基因 RT-PCR 擴增ure 1-2 RT-PCR results against hMPol for F gene with RNA from mock infeF gene with RNA from hMPV infected marker血清稀釋濃度的確定實驗，可以看出在抗原包板濃度為度 OD 值大致在 1 左右，且與對照濃度 1：100，血清稀釋濃度在 1：
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R725.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2686442