【摘要】： 背景吸入高濃度氧常被用于多種疾病的救治，以保證組織對(duì)氧的需求，但長(zhǎng)時(shí)間吸入高氧的同時(shí)也會(huì)引起肺結(jié)構(gòu)和功能的異常，以致影響生活質(zhì)量，嚴(yán)重者危及生命；對(duì)正在發(fā)育中的肺組織，高氧甚至?xí)䦟?dǎo)致其不可逆的畸形發(fā)育。支氣管肺發(fā)育不良是一種發(fā)生于早產(chǎn)兒尤其是極低出生體重兒的一種慢性肺疾病。以肺泡形成減少和微血管化異常為特征，與表面活性物質(zhì)的缺乏、氧化應(yīng)激、氣壓傷、炎癥反應(yīng)、肺泡纖維蛋白沉積、營(yíng)養(yǎng)以及遺傳背景等因素相關(guān)。肺泡化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其涉及包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、微血管的內(nèi)皮細(xì)胞等肺泡成份與細(xì)胞外的基質(zhì)之間多重的交互作用。目前仍然沒(méi)有一種有效的治療方法能夠逆轉(zhuǎn)或減緩這種疾病的進(jìn)程。 長(zhǎng)時(shí)間的高濃度氧氣吸入常引起肺部以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞增殖和肥大，細(xì)胞因子及凋亡活性增加為特征的炎癥反應(yīng)，及隨之而來(lái)的肺組織形態(tài)學(xué)改變。TNFα作為細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的起始因子，在高氧觸發(fā)的炎癥反應(yīng)中扮演著非常重要的角色，并與病理改變的嚴(yán)重性相關(guān)；在體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)TNFα抑制劑可防止高氧觸發(fā)的肺泡上皮細(xì)胞caspase 3的活化。TGF-β對(duì)于正常的肺泡發(fā)育是必須的，損傷和修復(fù)部位的成纖維細(xì)的積聚和活化部分是由TGF-β_1驅(qū)動(dòng)的，但持續(xù)過(guò)多的TGF-β信號(hào)卻在肺泡的纖維化和肺泡發(fā)育不良過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。 肺泡上皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用對(duì)于肺的功能的完整性至關(guān)重要，細(xì)胞縫隙連接(gap junction，GJ)是縫隙連接蛋白構(gòu)成的六聚合體跨膜蛋白通道結(jié)構(gòu)，是廣泛存在于動(dòng)物組織中的一種細(xì)胞間連接形式。這些復(fù)合物偶聯(lián)的細(xì)胞通過(guò)門(mén)控的軸孔連接相鄰細(xì)胞的胞質(zhì)成分，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞兩側(cè)及細(xì)胞內(nèi)外液體、離子、代謝產(chǎn)物的分布、轉(zhuǎn)移及傳遞細(xì)胞間的信號(hào)，對(duì)機(jī)體的代謝平衡和生長(zhǎng)發(fā)育等起重要作用。連接蛋白Connexin26(Cx26)是連接蛋白家族中的一員，研究證明Cx26存在于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中且組成Cx26／Cx32通道，在肺組織生理及損傷修復(fù)中具有重要作用。BPD的發(fā)生已被證明涉及細(xì)胞增殖，炎癥反應(yīng)和纖維化過(guò)程，氧化應(yīng)激，感染，及微血管發(fā)育等多種機(jī)制，如針對(duì)縫隙連接在高氧肺損傷的研究將為新生動(dòng)物肺損傷及修復(fù)提供新的思維。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來(lái)源于發(fā)育早期中胚層一類多能干細(xì)胞，具有分化為成血細(xì)胞以外的外胚層，中胚層和內(nèi)胚層的實(shí)質(zhì)細(xì)胞的多向分化的潛能，被稱為組織工程的“種子細(xì)胞”。已有較多的研究證實(shí)來(lái)源于成體的MSCs可以歸巢和／或參與肺組織的發(fā)育，從而提出基于干細(xì)胞的干預(yù)肺部疾病的療法的可行性。先前對(duì)于干細(xì)胞移植的動(dòng)物試驗(yàn)多采用裸鼠、NOD／SCID大鼠等，需要進(jìn)行造血組織的摧毀和／或免疫抑制治療，且移植后實(shí)驗(yàn)條件要求較高，對(duì)于異種間MSCs移植的免疫學(xué)方面的研究開(kāi)展較少，而MSCs其低免疫原性及抑制T細(xì)胞增殖的獨(dú)特免疫特性，在GVHD等方面具有潛在的臨床價(jià)值。加之新生大鼠先天性免疫系統(tǒng)不成熟，使得其有可能成為異基因移植的受體。就干細(xì)胞的移植途徑而言，靜脈途徑研究的最多，腹腔注射的途徑比較容易實(shí)施，且有報(bào)道比其他途徑更容易定植。 在本研究中，我們對(duì)正常和高氧暴露的新生大鼠采用經(jīng)腹腔注射人源性MSCs的方法，探討以新生建立異種MSCs移植模型動(dòng)物的可行性、植入細(xì)胞的命運(yùn)，以及對(duì)于高氧肺組織損傷的影響。體外實(shí)驗(yàn)中主要研究高氧對(duì)新生大鼠肺泡Ⅱ型細(xì)胞的影響及hMSCs共培養(yǎng)對(duì)其干預(yù)作用。本研究共分為五章： 第一章：人骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的人骨髓MSCs(hBMSCs)培養(yǎng)、純化、鑒定、并進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。方法：采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁細(xì)胞分離法培養(yǎng)hMSCs，觀察不同代細(xì)胞的形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)儀檢測(cè)表面抗原CD34、CD45、CD33、CD44、CD90及HLA-DR等的表達(dá)情況；對(duì)MSCs采用二甲基亞砜、巰基乙醇及丁羥茴醚等試劑以誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞分化，顯微鏡下觀察形態(tài)變化，免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果原代培養(yǎng)接種2～4h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，24h后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，3～4h貼壁率為65％～80％，2～3d就可見(jiàn)一些集落形成，4～5d后集落迅速增多，10d左右融合90％以上。hMSCs呈梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞不再以集落方式生長(zhǎng)，而呈均勻性分布生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀檢查顯示CD34、CD45、CD33陰性，HLA-DR陰性，CD44、CD90陽(yáng)性。誘導(dǎo)分化試驗(yàn)顯示誘導(dǎo)后1d時(shí)可見(jiàn)出現(xiàn)Nestin和NF-M陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)，至第5d時(shí)再次檢測(cè)可見(jiàn)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞減少，且陽(yáng)性程度較前減弱。NF-M陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)后在第5d增多多，染色陽(yáng)性程度更強(qiáng)。結(jié)論：成功培養(yǎng)出hMSCs，表面抗原標(biāo)志檢測(cè)為CD34、CD45、CD33陰性，HLA-DR陰性，CD44、CD90陽(yáng)性，在一定條件下具有轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞的能力。細(xì)胞重懸后加入預(yù)先包被有大鼠IgG的塑料培養(yǎng)瓶并置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)為5％CO_2的孵箱中培養(yǎng)。1h后倒出培養(yǎng)液，離心后棄上清，細(xì)胞重懸于加含抗生素及FBS(含體積分?jǐn)?shù)為10％)的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)為5％CO_2的孵箱中培養(yǎng)23小時(shí)。留取少許貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞作透射電鏡檢查，細(xì)胞漂片作免疫細(xì)胞化學(xué)染色包括AKP染色及SP-A抗原染色；苔盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞成活率。原代培養(yǎng)新生鼠AECⅡ放入Transwell-Clear底層上(預(yù)置蓋玻片)，隨機(jī)分為高氧+hBMSCs共培養(yǎng)(A)，單純高氧組(B)，空氣+hBMSCs共培養(yǎng)(C)，單純空氣組(D)等共四組，每組6復(fù)孔。A、B組置于95％O_2-5％CO_2條件下培養(yǎng)，而C、D組則在95％空氣-5％CO_2條件下培養(yǎng)；24h后留取上清并換液，A、C組在Inserts中加入hBMSCs進(jìn)行共培養(yǎng)，而B(niǎo)、D組則不加hBMSCs；24h后再取上清，采用ELASA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TNFα、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)基因的含量；Hoechst染色法檢測(cè)Transwell-Clear底部AECⅡ細(xì)胞凋亡情況。免疫組化法檢測(cè)Transwell-Clear Inserts中人骨髓MSC特異性SP-A的表達(dá)情況。結(jié)果倒置顯微鏡觀察：AECⅡ細(xì)胞呈圓形或立方形，純度高達(dá)(98±2)％，苔盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力為(98.15±3.12)％，透射電鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)板層小體。每5只3日齡SD大鼠經(jīng)分離純化貼壁后可獲AECⅡ細(xì)胞數(shù)平均為(90±9)×10~6�？諝饨M細(xì)胞培養(yǎng)24h后，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變；高氧組細(xì)胞貼壁欠佳，折光性差，少數(shù)細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)顆粒。共培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)：相差顯微鏡下顯示：底層細(xì)胞仍呈立方形或圓形；Inserts中的細(xì)胞初始形態(tài)圓形，漸漸變?yōu)樗笮�，貼附于Inserts膜上。AECⅡ免疫化學(xué)染色顯示AKP陽(yáng)性，SP-A陽(yáng)性；Hoechst凋亡檢測(cè)顯示：A、B兩組均可見(jiàn)到凋亡細(xì)胞，凋亡率分別為：4.9817±0.78617(％)，7.3183±0.71692(％)，而空氣組均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；ELISA檢測(cè)顯示A、B、C、D四組TNFα水平分別為共培養(yǎng)前51.797±10.815，55.708±11.475，21.168±3.835，21.459±4.481，共培養(yǎng)后則為29.501±2.169，41.458±9.765，20.822±2.605，21.429±3.448(交互效應(yīng)F=19.362，，p=0.000；組內(nèi)效應(yīng)F值=55.068，p=0.000；分組效應(yīng)F值=28.253，p=0.000，)；組間比較顯示，共培養(yǎng)前，A組與B組之間差異無(wú)顯著性(p＞0.05)，而共培養(yǎng)后差異均有顯著性(p＜0.05)。TGFβ1水平分別為共培養(yǎng)前2289.296±104.337，2339.0411±125.291，1337.835±149.936，1371.835±108.178，共培養(yǎng)后則為1683.296±112.384，2172.375±123.198，1409.441±111.994，1342.527±105.288；(交互效應(yīng)F=30.711，p=0.000；組內(nèi)效應(yīng)F值=45.840，p=0.000；分組效應(yīng)F值=129.695，p=0.000，)；組間比較顯示，共培養(yǎng)前，A組與B組之間差異無(wú)顯著性(p＞0.05)，而共培養(yǎng)后差異均有顯著性(p＜0.05)。A、C二組Inserts中的細(xì)胞SP-A抗體免疫組化檢測(cè)顯示兩組中均未見(jiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞。結(jié)論高氧暴露導(dǎo)致新生大鼠AECⅡ分泌功能改變，細(xì)胞凋亡增加；而與人骨髓MSC共培養(yǎng)對(duì)AECⅡ的損傷具有保護(hù)作用。 第三章：新生大鼠高氧肺損傷模型的建立及縫隙連接蛋白26的相關(guān)變化 目的建立新生大鼠高氧肺損傷的動(dòng)物模型，研究高氧新生大鼠肺組織結(jié)構(gòu)變化及連接蛋白connexin 26(Cx26)的表達(dá)情況。方法對(duì)3日齡新生大鼠采用95％氧濃度條件下暴露7天的方法制作新生大鼠高氧肺損傷模型，觀察大鼠的一般情況，HE染色法觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化及輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(radical alveolar counts，RAC)，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組織化學(xué)和原位雜交法檢測(cè)Cx26蛋白及mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果新生鼠高氧2d后活動(dòng)逐漸減少，反應(yīng)遲鈍，但全部成活；實(shí)驗(yàn)后高氧組、空氣組在體重、身長(zhǎng)等方面差異有顯著性；HE染色：光鏡下高氧組新生大鼠可見(jiàn)肺肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔內(nèi)見(jiàn)增多的肺泡巨噬細(xì)胞，肺間隔輕度-中度增寬，肺間質(zhì)細(xì)胞增多，有多少不等的間質(zhì)巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，而對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔無(wú)水腫、炎癥、纖維組織增生，肺泡腔無(wú)明顯滲出。RAG值分別為：高氧組9.60±0.67，正常組14.82±1.08；t=11.62，p=0.000，差異有非常顯著性。電鏡病理學(xué)檢查高氧組細(xì)胞間緊密連接短小或消失，部分區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜的連續(xù)性破壞，基底膜變薄、破壞及裸露，Ⅱ型肺泡細(xì)胞內(nèi)板層小體數(shù)量減少，表面活性物質(zhì)層喪失連續(xù)性，出現(xiàn)斷裂，可見(jiàn)聚集成塊或散落于肺泡腔，有的形成空泡；Ⅱ型肺泡上皮增生較明顯，肺泡間隔成纖維細(xì)胞增生明顯，膠原和彈性纖維可見(jiàn)。免疫組化顯示Cx26蛋白在空氣組表達(dá)比較局限，而高氧組彌散表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞比較分別為13.68±1.28％、17.82±1.72％，t=5.45，p=0.000。原位雜交示Cx26 mRNA的表達(dá)分別為10.335±1.694％、7.369±1.487％，t=3.721，p=0.002。結(jié)論成功建立新生大鼠高氧肺損傷模的動(dòng)物模型，高氧可導(dǎo)致大鼠肺組織Cx26蛋白和mRNA表達(dá)的發(fā)生改變，并可能與其修復(fù)有密切的關(guān)系。 第四章人骨髓源性MSCs移植新生大鼠的實(shí)驗(yàn)研究 目的研究移植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)新生大鼠的影響。方法以BrdU進(jìn)行標(biāo)記人骨髓來(lái)源MSCs；10日齡內(nèi)清潔級(jí)SD新生大鼠24只，隨機(jī)分為A、B、C三組，每組8只，A組：大劑量組，每只動(dòng)物腹腔注射含5×10~4MSCs的磷酸鹽緩沖液(PBS)50ul，B組：小劑量組，每只動(dòng)物腹腔注射含11×10~4MSCs的PBS 50ul，C組：對(duì)照組，每只動(dòng)物腹腔注射PBS 50ul。觀察移植后移植物抗宿主(GVHD)一般表現(xiàn)，3周后處死，ELASA法檢測(cè)血清TNFα；免疫組織化學(xué)檢查肝臟、脾臟、肺等臟器BrdU積分情況，HE染色觀察肝臟、結(jié)腸的病理GVHD分級(jí)。結(jié)果各組大鼠均未見(jiàn)腹瀉，弓背，翹毛，精神萎靡及皮膚潰瘍等表現(xiàn)。移植后3組大鼠在體重、血清TNFα水平等方面差異均無(wú)顯著性(F=0.415，P=0.666；F=1.112，P=0.344)，肝臟及結(jié)腸病理分級(jí)評(píng)分(x~2=0.793，P=0.583；x~2=1.080，P=1.080)，而免疫組化顯示對(duì)照組各臟器中均未見(jiàn)BrdU陽(yáng)性染色細(xì)胞，兩移植組在肺、肝臟、脾臟等中均可見(jiàn)均可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性染色細(xì)胞。尤以肺部明顯，三組肺部BrdU染色積分分別為0.261±0.023，0.215±0.019；0.000±0.000(F=500.347，p=0.000)，A、B兩組間差異有顯著性(P=0.000)。結(jié)論腹腔注射MSCs后肺、肝臟、脾臟等臟器均有MSCs定植，且與注射的MSCs量相關(guān)；新生大鼠移植人骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞后未發(fā)生明顯的GVHD。 第五章：人骨髓來(lái)源MSCs對(duì)新生大鼠高氧肺損傷的干預(yù)作用 目的研究人骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)新生大鼠高氧肺損傷的干預(yù)作用。方法采用貼壁選擇法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增hMSCs，并予BrdU進(jìn)行標(biāo)記；32只3日齡SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D四組，每組8只；A組：高氧+hMSCs組，B組：空氣+hMSCs組，C組：高氧對(duì)照組，D組：空氣對(duì)照組。A、C組：高氧(95％)暴露7天后，腹腔分別注射含5×10~4MSC的磷酸鹽緩沖液(PBS)、單純的PBS 50ul，B、D組：空氣暴露7天后，腹腔分別注射含5×0~4hMSCs的PBS、單純的PBS 50ul。3天后處死全部動(dòng)物取肺組織，ELASA法檢測(cè)肺組織勻漿TNFα、TGFβ1水平；免疫組織化學(xué)檢查BrdU積分情況，HE染色檢測(cè)RAC；RT-PCR檢測(cè)Alu序列表達(dá)情況。結(jié)果四組TNFα水平分別為142.933±24.017，79.033±11.573，224.088±41.915，76.500±10.373(F=59.970，P=0.000)；TGFβ1水平分別為1726.484±91.086，1530.359±173.441，2047.717±152.057，1515.777±131.049(F=24.977，P=0.000)；RAC值11.145±1.331，13.941±0.985，9.595±0.672，14.819±1.080(F=43.234，P=0.000)；RT-PCR檢測(cè)顯示A、B組均有Alu序列表達(dá)，而C、D組均未見(jiàn)Alu序列表達(dá)；免疫組化顯示A、B組均有BrdU陽(yáng)性染色細(xì)胞，BrdU積分分別為0.230±0.026，0.190±0.015，C、D組積分均為0 (F=532.763，p=0.000)。結(jié)論腹腔注射hMSC后肺組織有h MSCs定植，且與暴露的條件相關(guān)；hMSCs可改善新生大鼠因高氧引致的肺損傷。
【圖文】：

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博士學(xué)位論文圖1一l培養(yǎng)24h，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，少數(shù)細(xì)胞貼壁(倒置xl00)Figl一 1someeellssticktowall24hafter eultured(magnifieation100)圖l一 272h散在的貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形(相差X100)Figl一 2eellsshaPedlong一 shuttle72h aftercultured(magnifieation100)圖1一3培養(yǎng)第5d，MSCs集落增多(相差x400)Figl一 3AfewofColonyofMSCson DS(magnifieation400)圖1一47天左右達(dá)到80%完全融合(倒置x400)Figl一
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 田兆方;杜江;王斌;洪小楊;封志純;;人骨髓源性MSCs移植新生大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J];廣東醫(yī)學(xué);2006年10期

2 田兆方;杜江;王斌;洪小楊;封志純;;靜脈注射大鼠骨髓MSCs緩解新生大鼠高氧肺損傷[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年03期

3 田兆方;杜江;王斌;洪小楊;封志純;;骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)高氧新生大鼠肺組織細(xì)胞間黏附分子1表達(dá)的影響[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2006年14期

4 張怡X,王冬梅,袁紅豐,李海民,白慈賢,張銳,陳琳,唐鎖勤,裴雪濤;利用新生大鼠建立人/大鼠造血嵌合體模型[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2003年03期

5 夏云金,高清平,萬(wàn)楚成,程范軍,劉志祥,郭仁慈;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病和移植物抗白血病的影響[J];中華血液學(xué)雜志;2005年07期

本文編號(hào)：2673011