【摘要】： 孤獨癥(autism)是由多因素引起的以社會交往障礙、言語發(fā)育障礙、興趣范圍狹窄和刻板重復(fù)的行為方式為基本臨床特征的嚴重神經(jīng)精神障礙,一般在三歲之前發(fā)病。國外流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),孤獨癥在兒童群體中的患病率不低于1.3‰,男女比例約為4.3:1。近40余年來的研究證明孤獨癥是由多個基因相互作用引起的,遺傳因素在其發(fā)病中起到主要作用的觀點已得到越來越多的學(xué)者與臨床醫(yī)生的認可,但哪些基因與孤獨癥的發(fā)病相關(guān)尚不得而知�；谌蚪M的連鎖分析提示7號染色體長臂是重復(fù)性最好的和孤獨癥高度連鎖的部位。本課題選擇了該染色體上的兩個基因RELN、GRM8,并運用病例對照方法對RELN、GRM8基因上的12個SNPs位點以及單體型和孤獨癥之間進行了關(guān)聯(lián)分析,探討RELN、GRM8基因是否為中國漢族兒童孤獨癥的易感基因。本次對RELN、GRM8基因和孤獨癥的相關(guān)性研究,為我們進一步明確孤獨癥發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)提供了客觀依據(jù),也為將來進一步研究孤獨癥的分子發(fā)生機制提供了方向。 孤獨癥的復(fù)雜性狀是導(dǎo)致基因連鎖和相關(guān)分析結(jié)果不一致的一個重要原因,內(nèi)在表型(endophenotype)的提出,使得組成遺傳學(xué)上同質(zhì)的人群用于基因的連鎖和相關(guān)分析成為可能。在整個孤獨癥譜系障礙中,社會交往障礙是最具特色和核心的表現(xiàn),許多高功能孤獨癥和Asperger綜合征患者的智力可能并不低下,但在社會交往方面往往表現(xiàn)明顯的溝通障礙。這意味著孤獨癥患者的社會認知功能可能存在著一個相對獨立的神經(jīng)機制和遺傳背景。SRS(Social Responsiveness Scale)社會反應(yīng)量表是迄今為止唯一可以被用來對孤獨癥特異社會化障礙嚴重程度進行量化評估的工具。本實驗旨在通過運用SRS量表對孤獨癥患者、智齡匹配的唐氏綜合征患兒和正常對照兒童進行SRS社會交往能力的評估并對結(jié)果進行分析,探討在中國漢族孤獨癥患兒中,SRS社會反應(yīng)量表所評估的結(jié)果是否也反映了孤獨癥譜系障礙特異的社會認知發(fā)展,孤獨癥固有的社會化障礙是否和文化、種族的差異無關(guān),并有望被作為內(nèi)在表型和基因進行連鎖和相關(guān)性研究。 第一部分兒童孤獨癥與RELN基因單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性研究 方法:1、樣本采集和基因組DNA抽提:按照國際疾病分類(ICD-10)和精神疾病診斷和統(tǒng)計手冊(DSM-Ⅵ)診斷孤獨癥。選擇孤獨癥患者213例,同時收集無神經(jīng)系統(tǒng)疾患的正常血標(biāo)本(對照組)160例。基因組DNA抽提采用氯化氨抽提法,保存?zhèn)溆谩?、SNPs的選擇和分型:利用生物信息數(shù)據(jù)庫查找目的基因的多態(tài)性位點(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/),共選取位于外顯子、內(nèi)含子和5'剪切部位上的8個SNPs位點(SNP1-SNP8);運用上海復(fù)旦的GenomelabSNPstream超高通量基因分型系統(tǒng)(Beckman Coulter)對所選SNPs進行分型。3、RELN基因和孤獨癥相關(guān)性的統(tǒng)計學(xué)分析:包括所測得基因型頻率的Hardy-Weinberg在對照組中的遺傳平衡檢驗;每一個SNP與孤獨癥之間在不同遺傳模式下的相關(guān)性分析;不同SNPs標(biāo)記之間的連鎖不平衡分析;構(gòu)建單體型,估算單體型頻率以及不同單體型和孤獨癥的相關(guān)性分析。所有以上統(tǒng)計分析的顯著性差異的P值水平為＜0.05。 結(jié)果:1、單個SNP和孤獨癥的相關(guān)分析結(jié)果顯示,位于RELN基因59號內(nèi)含子部位的一個SNP(SNP2,rs736707)和孤獨癥存在顯著的相關(guān)性(OR:0.72,95%CI:0.54-0.97.P=0.03),遺傳模式為加性模式;2、根據(jù)連鎖不平衡分析結(jié)果,構(gòu)建了兩個由相鄰位點存在顯著相關(guān)(D'＞0.75)的SNPs組成的單體型(SNP1/SNP2/SNP3/SNP4,SNP6/SNP7);3、不同單體型和孤獨癥的相關(guān)分析顯示,包含有RELN基因59號內(nèi)含子SNP位點的單體型(SNP1/SNP2/SNP3/SNP4)和孤獨癥顯著相關(guān)(P=0.027)。 結(jié)論:1、國內(nèi)首次選取RELN基因作為侯選基因和漢族孤獨癥患兒進行關(guān)聯(lián)研究,結(jié)果顯示RELN基因59號內(nèi)含子部位的一個SNP(SNP2,rs736707)與孤獨癥存在顯著相關(guān),遺傳模式為加性模式。2、運用相鄰SNPs構(gòu)建了RELN基因上的兩個單體型,其中一個單體型(SNP1/SNP2/SNP3/SNP4)和孤獨癥存在顯著性相關(guān),遺傳模式為加性模式,這提示在跨越SNP1、SNP2、SNP3和SNP4區(qū)域或臨近區(qū)域上至少有一個和孤獨癥相關(guān)的易感位點。3、RELN基因可能為中國漢族孤獨癥患兒的易感基因。 第二部分兒童孤獨癥與GRM8基因單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性研究 方法:1、樣本采集和基因組DNA抽提:按照國際疾病分類(ICD-10)和精神疾病診斷和統(tǒng)計手冊(DSM-Ⅵ)診斷孤獨癥。選擇孤獨癥患者213例,同時收集無神經(jīng)系統(tǒng)疾患的正常血標(biāo)本(對照組)160例�；蚪MDNA抽提采用氯化氨抽提法,保存?zhèn)溆谩?、SNPs的選擇和分型:利用生物信息數(shù)據(jù)庫查找目的基因的多態(tài)性位點(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/),在GRM8基因3'端選取了3個SNPs,啟動子部位選取了1個SNP共4個SNPs位點(SNP9～SNP12);運用上海復(fù)旦的Genomelab SNPstream超高通量基因分型系統(tǒng)(Beckman Coulter)對所選SNPs進行分型。3、GRM8基因和孤獨癥相關(guān)性的統(tǒng)計學(xué)分析:包括所測得基因型頻率的Hardy-Weinberg在對照組中的遺傳平衡檢驗;每一個SNP與孤獨癥之間在不同遺傳模式下的相關(guān)性分析;不同SNPs標(biāo)記之間的連鎖不平衡分析:構(gòu)建單體型,估算單體型頻率以及不同單體型和孤獨癥的相關(guān)性分析。所有以上統(tǒng)計分析的顯著性差異的P值水平為＜0.05。 結(jié)果:1、單個SNP和孤獨癥的相關(guān)分析結(jié)果顯示,GRM8基因上的4個SNPs位點和孤獨癥之間均未發(fā)現(xiàn)有顯著性相關(guān)(P＞0.05);2、根據(jù)連鎖不平衡分析結(jié)果構(gòu)建了一個由相鄰SNPs位點存在顯著相關(guān)(D'＞0.75)的單體型(SNP9/SNP10/SNP11);3、單體型和孤獨癥的相關(guān)分析顯示,單體型SNP9/SNP10/SNP11和孤獨癥之間不存在顯著相關(guān)(P＞0.05)。 結(jié)論:1、國內(nèi)首次選取GRM8基因作為侯選基因和漢族孤獨癥患兒進行關(guān)聯(lián)研究,結(jié)果顯示4個SNPs中,均未發(fā)現(xiàn)與孤獨癥存在顯著性相關(guān)。2、在GRM8基因3'端構(gòu)建了一個單體型SNP9/SNP10/SNP11,未見其與孤獨癥存在顯著性相關(guān)。3、GRM8基因可能并不是導(dǎo)致中國漢族兒童孤獨癥的易感基因。 第三部分孤獨癥的社會化障礙分析 方法:1、SRS社會反應(yīng)量表的評估:對孤獨癥組、智齡匹配的唐氏綜合征組和正常對照組兒童進行社會交往能力的評估,并得到一個單一的分值(包括粗分及標(biāo)準分),分值越高,說明社會化障礙越嚴重。2、單因素方差分析(One-wayANOVA):當(dāng)各組SRS得分均值之間存在顯著性差異時,再進行Post-hoc兩兩比較,統(tǒng)計分析顯著性差異的尸值水平為＜0.05。 結(jié)果:SRS社會反應(yīng)量表評估及統(tǒng)計分析結(jié)果:三組之間SRS評分均存在顯著性差異(SRS粗分:F=149.57,P＜0.01;SRS標(biāo)準分:F=106.11,P＜0.01);SRS粗分均值在三組之間的高低分布為:孤獨癥組(96.77±15.27)＞唐氏綜合征組(60.17±18.85)＞正常兒童對照組(29.68±10.63)。Post-Hoc檢驗提示孤獨癥組、唐氏組和正常兒童對照組之間均存在顯著性差異(P＜0.01);唐氏組和孤獨癥組之間也存在顯著性差異(P＜0.01):SRS標(biāo)準分均值在三組之間的高低分布為:孤獨癥組(80.92±8.15)＞唐氏綜合征組(65.67±11.52)＞正常兒童對照組(49.32±5.70)。Post-Hoc檢驗提示孤獨癥組、唐氏組和正常兒童對照組之間均存在顯著性差異(P＜0.01);唐氏組和孤獨癥組之間也存在顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論:1、國內(nèi)首次采用SRS社會反應(yīng)量表對社交障礙表型進行量化評估,結(jié)果提示SRS量表的評估反映了漢族孤獨癥患兒特有的社交障礙。2、SRS量表評估所反映的孤獨癥患兒固有的社會化障礙不存在文化和種族上的差異。
【圖文】：

mGluRSmRNA主要在嗅球、橋腦灰質(zhì)、丘腦外側(cè)網(wǎng)狀核和梨狀皮質(zhì)內(nèi)表達[40]。它們的激活可以導(dǎo)致細胞內(nèi)的第二信使。AMP生成降低，從而發(fā)揮對谷氨酸釋放的負反饋調(diào)節(jié)[4’碎2](圖2)。因此，mGluRs通過突觸前機制對谷氨酸釋放的抑制，，將會對與谷氨酸相關(guān)的病理和生理過程產(chǎn)生重要影響。GRMS基因功能異常可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損害。撕兩.扣即椒栩而如創(chuàng)由.甲I幾I目.舀匆R，公粼贖式…髓.物:版跳叭創(chuàng)廠一、鮮，m口加成p.份卿印血礪.帥.遙書鎮(zhèn)圖2代謝性谷氨酸受體(mGlu稱)激動后蛋白激酶的活化:mGlulb通過激活激酶級聯(lián)系統(tǒng)，同時其自身也可以作為磷酸化的底物，最終對突觸傳遞和功能進行調(diào)節(jié)。第1組 mGluRs(mGluRI和mGI權(quán)RS)主要位于突觸后膜，通過二酞基甘油(DAG)和增加胞漿內(nèi)的G擴十而激活蛋白激酶c(PKc)，同時通過增加。AMP含量激活PKA;l型mGluRs激活絲裂原活化蛋白激酶

圖1:咫LN基因的連鎖不平衡分析(D:代表單體型頻率預(yù)測值和觀察值之間的差異;D’:LD的相對大小，范圍從l到1;R:相關(guān)系數(shù)。).單體型與孤獨癥的關(guān)聯(lián)分析同樣基于邏輯回歸方法，我們對所構(gòu)建的單體型與孤獨癥進行了關(guān)聯(lián)分析。果發(fā)現(xiàn)包含有SNPZ的單體型SNPI/SNPZ/SNP3/SNP4與孤獨癥存在顯著的相關(guān)(P=0.027)，默認遺傳模式為加性模式。A一T-C一T組合在正常對照中的分布頻比在孤獨癥患兒中要高(oR:1.54，95%Cl:1.00一2.36)。未發(fā)現(xiàn)SNp6/SNp7與孤癥的相關(guān)性(表4)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R749.94

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 靜進;社會腦與孤獨癥兒童的社會認知[J];中國兒童保健雜志;2004年05期

本文編號：2662184