【摘要】：目的:呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原,也是造成老年人和免疫缺陷成人高患病率和死亡率的重要原因。接種疫苗是預(yù)防傳染性疾病的重要措施,接種者自然感染RSV后往往導(dǎo)致加重的Th2型優(yōu)勢(shì)應(yīng)答和肺部炎癥性病理損傷,這是RSV疫苗成功的主要障礙。幾十年來,闡明RSV的感染機(jī)制和疫苗增強(qiáng)性肺部免疫病理的發(fā)病機(jī)制一直是RSV研究領(lǐng)域的最前沿,是研制安全有效的治療措施和RSV疫苗的重要理論基礎(chǔ)。 發(fā)病機(jī)制的研究離不開理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice ,PVM)與人RSV(hRSV)同屬副粘病毒科、肺病毒亞科、和肺病毒屬,小鼠是PVM的天然宿主,極少量病毒即可導(dǎo)致嚴(yán)重感染,PVM感染小鼠可以復(fù)制RSV嚴(yán)重感染嬰幼兒的臨床特征和炎癥病理。本研究用PVM感染新生4-7天和成年6-9周的雌性BALB/c小鼠,考察PVM感染后在新生小鼠和成年小鼠模型中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和肺部病理變化,是發(fā)展有效的治療措施和研制安全有效的RSV疫苗的重要理論基礎(chǔ)。 方法: 1制備PVM并用BHK-21細(xì)胞滴定。 2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將新生4-7天和成年6-9周BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組,每組6只,分別為:(1)新生4-7天BALB/c小鼠感染組,(2)新生4-7天BALB/c小鼠對(duì)照組,(3)6-9周BALB/c小鼠感染組,(4)6-9周BALB/c小鼠對(duì)照組。新生組用375 TCID50 PVM感染,成年組用500 TCID50 PVM感染。 2.1每天稱量小鼠體重,觀察體重變化。 2.2取新生感染組和新生對(duì)照組感染后1、3、5、7、9、11、14和18天的肺組織,提取總RNA,用半定量PCR擴(kuò)增PVM基因SH,考察小鼠肺組織中PVM感染情況。染后肺部炎癥細(xì)胞的變化。 2.4留取感染后3、7、14天小鼠的肺組織做病理切片,HE染色,觀察肺組織中炎癥浸潤(rùn)及組織損傷。 2.5用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)感染后1、3、5、9、14天肺組織的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12,Th2型細(xì)胞因子IL-5、IL-6、IL-13,干擾素IFN-α、IFN-β,腫瘤壞死因子TNF-α,趨化因子MCP-1、MIP-1α、CCL5、MCP-3,黏液因子gob5,考察感染后Th1/Th2應(yīng)答情況,以及肺部炎癥反應(yīng)情況。 2.6感染后14天取血分離血清,用ELISA法測(cè)定血清IgG抗體效價(jià)。 2.7成年組的檢測(cè)指標(biāo)同新生組,不同的是成年組增加了感染后4h組。 結(jié)果: 1制備了實(shí)驗(yàn)所需的PVM病毒,滴度為TCID50=107.5/ml 2體重變化情況新生小鼠感染組與新生對(duì)照組相比,感染后4天體重減輕,感染后7天體重下降至最低,然后體重開始慢慢增加,到14天與對(duì)照組無差異。成年感染組與成年對(duì)照組相比,感染后3天體重開始迅速下降,5天降至最低,7天開始體重慢慢增加,8天逐漸恢復(fù)正常。 3半定量PCR擴(kuò)增PVM基因SH新生小鼠感染PVM后1天基因SH條帶亮度比較弱,感染后5天條帶最亮,感染后7天和9天條帶亮度較弱,至18天消失。成年小鼠感染PVM 4小時(shí)后基因SH條帶亮度較新生小鼠感染1天后亮,感染后3天和5天達(dá)高峰,7天、9天稍微減弱, 14天進(jìn)一步減弱,至18天消失。 4肺組織HE染色新生和成年對(duì)照組小鼠,肺泡壁結(jié)構(gòu)完整,無水腫,周圍僅有少量炎性細(xì)胞;新生感染組與對(duì)照組相比,感染后3天肺間質(zhì)炎性細(xì)胞增多,肺泡壁增厚;感染后7天明顯增多,肺泡壁增厚,水腫,其中大部分為淋巴細(xì)胞,可見單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞,14天炎癥減弱;成年感染組感染后3天和7天,均有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁嚴(yán)重充血、水腫,有出血點(diǎn),肺泡間隔融合,14天炎癥減弱。 2.3將肺沖洗液中的細(xì)胞經(jīng)瑞士-吉姆薩染色,計(jì)數(shù)各種有核細(xì)胞,觀察感成年小鼠感染PVM 3天和7天后支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)均大于新生感染組,成年組感染后3天中性粒細(xì)胞比例是53.25%,7天組中性粒細(xì)胞比例是67.00%,而新生小鼠感染后3天中性粒細(xì)胞比例是0.00%, 7天組中性粒細(xì)胞比例是27.00%,另外,成年組淋巴細(xì)胞比例也高于新生小鼠,表明成年小鼠感染PVM后比新生感染組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度嚴(yán)重。 6 ELISA法檢測(cè)小鼠感染14天后血清中特異性抗體IgG 與對(duì)照組相比,新生感染組和成年感染組均產(chǎn)生了IgG抗體,且有顯著性差異(P0.05),成年感染組IgG抗體效價(jià)(1/400)高于新生感染組(1/200)的效價(jià)。 7肺組織中細(xì)胞因子的表達(dá)情況 新生小鼠感染PVM后3天肺組織的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ顯著高于對(duì)照組(P0.05),之后繼續(xù)升高,9天時(shí)是對(duì)照組的150倍;感染后IL-12表達(dá)量與對(duì)照組無差異(P0.05)。 成年小鼠感染PVM后肺組織Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12表達(dá)量均與對(duì)照組有顯著差異(P0.05),IFN-γ表達(dá)量感染后1天即顯著高于對(duì)照組,5天時(shí)最高,是對(duì)照組的133倍,9天開始下降。IL-12感染后5天是對(duì)照組的2倍(P0.05),之后與對(duì)照組無差異(P0.05)。 新生小鼠感染后Th2型細(xì)胞因子IL-5、IL-13與對(duì)照組無差異(P0.05),成年小鼠感染后IL-5與對(duì)照組無差異(P0.05),感染后5天IL-13表達(dá)量是對(duì)照組的4倍(P0.05). 新生小鼠感染后3天肺組織IL-6表達(dá)量達(dá)高峰(P0.05),是對(duì)照組的17倍,5天恢復(fù);成年組IL-6表達(dá)量5天達(dá)高峰,是對(duì)照組的18倍。 在成年和新生鼠中,IFN-α均于感染早期迅速增加,之后急速下降;IFN-β在新生鼠中的表達(dá)動(dòng)力學(xué)與IFN-α一致,但在成年鼠中IFN-β在感染早期開始表達(dá),5天才達(dá)高峰。 新生小鼠感染后9天腫瘤壞死因子TNF-α是對(duì)照組的30倍(P0.05),而成年小鼠感染后4小時(shí)TNF-α肺部表達(dá)量是對(duì)照組的76倍(P0.05),1天后逐漸降低,至14天和對(duì)照組無差異(P0.05) 新生小鼠感染后趨化因子MCP-1、MCP-3、MIP-1α和CCL5均與對(duì)照組有顯著差異(P0.05),感染后3天肺組織MCP-1表達(dá)量是對(duì)照組的41倍,至14天低于對(duì)照組(P0.05).感染后5天肺組織MCP-3表達(dá)5支氣管肺泡灌洗液中觀察炎性細(xì)胞變化情況量是對(duì)照組的118倍,至14天與對(duì)照組無差異(P0.05), MIP-1α感染后5天是對(duì)照組的21倍;感染后3天CCL5是對(duì)照組的2倍(P0.05);成年小鼠感染PVM后5天MCP-1是對(duì)照組的120倍(P0.05),至14天是仍高于對(duì)照組,MCP-3感染后5天是對(duì)照組的195倍(P0.05),14天仍高于對(duì)照組,MIP-1α感染后1天是對(duì)照組的50倍(P0.05),至14天時(shí)也仍高于對(duì)照組(P0.05),感染后1天CCL5是對(duì)照組的5.5倍(P0.05)。 黏液因子gob5的肺部表達(dá)量新生和成年感染組均與對(duì)照組有顯著差異(P0.05),新生小鼠感染后9天是對(duì)照組的6倍,而成年小鼠感染后5天是對(duì)照組的16倍,感染后9天是對(duì)照組的11倍,至14天消失,說明新生小鼠感染PVM后粘液分泌的變化。 結(jié)論: PVM感染新生和成年BALB/c小鼠均可導(dǎo)致肺部的炎癥病理反應(yīng),成年小鼠的炎癥反應(yīng)比新生小鼠更強(qiáng)烈,類似于RSV嚴(yán)重感染的嬰幼兒。
【圖文】：

毒科、肺病毒亞科、和肺病毒屬（圖 1），小鼠是 PVM 的天然宿主量病毒即可導(dǎo)致嚴(yán)重感染；PVM 感染小鼠可以復(fù)制 RSV 嚴(yán)重感染的臨床特征和炎癥病理。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）過敏和感染究所近幾年對(duì) PVM/小鼠模型做了大量的研究，他們發(fā)現(xiàn) PVM 感導(dǎo)致的下呼吸道強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)、水腫、粒細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子和趨炎癥介質(zhì)譜等與 RSV 感染的重癥患兒的臨床癥狀及病理反應(yīng)幾；PVM/小鼠模型已被廣泛用于 RSV 感染人類的機(jī)制研究。然而，染新生小鼠的系統(tǒng)研究未見報(bào)道，而新生兒和幼兒是 RSV 的主要象。本研究用 PVM 感染新生 4-7 天和成年 6-9 周的雌性 BALB/c 小察 PVM 感染后在新生小鼠和成年小鼠模型中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答、炎和肺部病理變化，為本課題組今后用該模型研究 hRSV 的感染機(jī)制增強(qiáng)性肺部炎癥病理機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R725.6

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