【摘要】：背景 慢性肺疾病(chronic lung disease, CLD)是早產(chǎn)兒常見的并發(fā)癥之一,其最終結(jié)局為肺組織纖維化,是早產(chǎn)兒致殘、致死的重要原因。約10%-15%的患兒于生后1年內(nèi)死于呼吸衰竭,存活者也需要長期依賴氧氣或呼吸機治療,直接影響患兒日后的生活質(zhì)量,給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟和精神負(fù)擔(dān)。隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,極低出生體重兒的存活率明顯提高,慢性肺疾病的總發(fā)病率呈逐年上升趨勢,國外報道目前在所有新生兒中慢性肺疾病的發(fā)病率為1.5%,已成為新生兒重癥監(jiān)護室(NICU)最棘手的問題之一。 CLD的發(fā)病機制十分復(fù)雜,但其本質(zhì)是在遺傳易感性的基礎(chǔ)上,各種醫(yī)源性因素(如氧中毒、氣壓傷或容量傷)以及感染和炎癥等對發(fā)育不成熟的肺造成的損傷,最終導(dǎo)致肺組織異常修復(fù)。目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)在慢性肺疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮了極其關(guān)鍵的作用,而細(xì)胞因子是參與肺內(nèi)炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì),促進著CLD的發(fā)生和發(fā)展,但確切機制至今仍不明確。已有大量研究評估了CLD或CLD高風(fēng)險者的羊水、臍帶血、血漿、氣道分泌物中細(xì)胞因子的情況,表明肺組織或支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等前炎癥因子早期呈高水平并持續(xù)表達,發(fā)生于各種病因造成的CLD中,但持續(xù)時間尚有爭議。趨化因子包括單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1,MCP-2,MCP-3,巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-1α,MIP-1β均和慢性肺疾病有關(guān)。氣道分泌物中MCP-1的濃度升高與解脲脲原體氣道定植(發(fā)生CLD的危險因素之一)有關(guān)。支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-10、IL-12、IL-13等抗炎細(xì)胞因子未分泌或不規(guī)則分泌可能導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)失控而持續(xù)存在,最終纖維組織增生而導(dǎo)致CLD發(fā)生。但是也有一些研究并未能證實上述結(jié)果：有研究顯示支氣管肺泡灌洗液及血中IL-6、TFN-α、IL-1β的水平與CLD的發(fā)生無相關(guān)性；還有實驗發(fā)現(xiàn)CLD患兒的BALF中,IL-10等下調(diào)炎癥因子與其他患兒相比無變化。 故哪些細(xì)胞因子確實參與了CLD的發(fā)生,CLD的急性期和非急性期起作用或起關(guān)鍵作用的因子各有哪些,各因子之間關(guān)系如何,是否病程前后起作用的因子都一樣,或只有急性期有細(xì)胞因子參與,患兒的外周血中這些細(xì)胞因子是否也發(fā)生了類似的變化,具體持續(xù)時間等等,仍需進一步探討。國內(nèi)外對于CLD細(xì)胞因子的研究大都著眼于肺部局部,對于CLD患兒全身免疫狀態(tài)的研究較少。研究以動物實驗居多,臨床研究很少,且臨床研究的樣本量一般較少�；純喝�(xì)胞因子的研究很少。全身免疫是否參與CLD的發(fā)病機制,CLD不同階段患兒全身免疫狀態(tài)如何,與肺部的局部免疫是否具有相關(guān)性,這些問題鮮見相關(guān)文獻報道。 由于樣本處理和檢測方法的不同,細(xì)胞因子的檢測結(jié)果差別很大,無固定參考數(shù)值可用來比較。通過對1個的或個別幾個細(xì)胞因子的檢測并不能反映細(xì)胞因子相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),解決這個問題的關(guān)鍵是要有統(tǒng)一的樣本處理方法,使用靈敏度高,且能同時檢測多種因子的的檢測儀器。液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)是唯 一種通過美國FDA認(rèn)證的芯片檢測系統(tǒng),可以滿足快速、微量、同時檢測多種細(xì)胞因子的需要,降低檢測誤差。本研究將液態(tài)懸浮芯片技術(shù)應(yīng)用于CLD的細(xì)胞因子檢測,解決早產(chǎn)兒采血量少、檢測指標(biāo)多的矛盾,可同時檢測全血中的17個細(xì)胞因子。 目的 通過研究早產(chǎn)兒慢性肺疾病(CLD)全血中17個細(xì)胞因子的表達,探討全身性免疫因素在慢性肺疾病中的可能作用,為尋求CLD的新的治療方法、指導(dǎo)有針對性的免疫調(diào)節(jié)治療在CLD中的應(yīng)用、改善患兒的預(yù)后提供可靠的理論依據(jù)。 方法 1、免疫刺激劑的選擇劉占國等(珠江醫(yī)院免疫移植研究所)的既往研究表明,PHA濃度10ug/ml、刺激全血12小時,為最佳的全血細(xì)胞細(xì)胞因子分泌刺激劑。因此我們選擇PHA作為刺激劑,濃度10ug/ml,刺激時間為12小時。 2、研究對象的選擇2007年10月至2009年3月,收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院、南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院、廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院、廣州市兒童醫(yī)院、廣東省人民醫(yī)院五家三甲醫(yī)院新生兒利NICU患兒為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)、早產(chǎn)兒;2)、胎齡體重?zé)o顯著性差異：3)、住院滿28天；4)、根據(jù)28天能否脫離氧氣分為兩組：慢性肺疾病組(不能脫氧)和對照組(不需要氧)。排除標(biāo)準(zhǔn)：先天性肺發(fā)育不良等原因造成的氧依耐予以排除。在28d時采集外周血標(biāo)本。取得患兒家屬的同意后選擇患兒未稀釋的肝素化全血2ml作為研究樣本(同分離的單個核細(xì)胞以及稀釋的全血樣本相比,能更好的模擬全血細(xì)胞所處的內(nèi)環(huán)境,更能反映體內(nèi)的情況)。我們一共收集到27例標(biāo)本,1例為先天性肺發(fā)育不良予以剔除,故供分析標(biāo)本共26例。其中慢性肺疾病組14例,對照組12例。胎齡為28-33周,體重為700-2500g,兩組孕周及體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(胎齡Z=-1.794,P=0.0729；體重Z=-0.464,P=0.643)。 3、細(xì)胞因子檢測方法的選擇在細(xì)胞因子檢測方面,單一細(xì)胞因子的檢測并不能反映細(xì)胞因子相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),故傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等均無法滿足我們的需求,液態(tài)懸浮蛋白芯片技術(shù)將流式檢測與芯片技術(shù)結(jié)合在一起,可以一次檢測一份樣本中多達100種細(xì)胞因子的水平,而且檢測時間短(大概2小時),可以滿足我們?nèi)婵焖俜治鋈卸喾N細(xì)胞因子的要求,因此我們選擇通過了美國FDA認(rèn)證的液態(tài)懸浮蛋白芯片技術(shù)作為細(xì)胞因子的檢測技術(shù)。 4、統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,偏態(tài)分布的組間比較采用兩個獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗,所測數(shù)據(jù)以中位數(shù)、平均秩次表示,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用方差齊的t檢驗,所測數(shù)據(jù)以X±S表示；兩組間性別分布比較采用Fisher's Exact Test.以α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果 1、慢性肺疾病組和對照組的一般情況 26例標(biāo)本中CLD組14人,其中男11例,女3例,28-32周的13例,32周的1例,1000g的2例,1000g-1500g的7例,1500g-2500g的5例；對照組12例,其中男9例,女3例,28-32周的11例,32周的1例,1000g的1例,1000g-1500g的7例,1500g-2500g的4例。兩組性別分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000),CLD組男性與女性比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。兩組均有相似的基礎(chǔ)治療：防治感染、改善微循環(huán)、補充微量元素、維持電解質(zhì)和酸堿平衡、靜脈營養(yǎng)支持等。不同之處：CLD組到生后28d采血時仍需要氧療,對照組不需要。 2、慢性肺疾病組和對照組的17個細(xì)胞因子水平 對慢性肺疾病組和對照組的17個細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、GM-CSF,IFN-γ,TNF-α,G-CSF,MCP-1、MIP-1β分別進行組間比較。兩組的GM-CSF、IL-7、IL-4、IL-13、IL-17、G-CSF、IFN-γ、IL-5、IL-12對刺激劑幾乎無反應(yīng)或反應(yīng)較差。兩組的17個細(xì)胞因子水平：IL-1β:Z=-1.234,P=0.217;IL-2:Z=-0.522,P=0.602;IL-4:Z=-0.267, P=0.789;IL-5:Z=-0.874,P=0.382;IL-6:Z=-0.206,P=0.837;IL.7:Z=-1.668, P=0.095;IL-8:t=-0.764,P=0.452;IL-10:t=-0.947,P=0.353;IL-12:Z=-0.440, P=0.660;IL-13:Z=-0.749,P=0.454;IL.17:Z=-0.515,P=0.606:GM-CSF: Z=-1.251,P=0.211;G-CSF:Z=-0.945,P=0.344；MCP-1:Z=-0.900,P=0.368: IFN-γ:Z=-0.313,P=0.754;TNF-α:Z=-0.721,P=0.471,以上16個細(xì)胞因子P0.05,兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MIP-1β:Z=-2.623,P=0.009,P0.05。盡管16個細(xì)胞因子無統(tǒng)計學(xué)上的差異,但是我們分析數(shù)據(jù)仍可以發(fā)現(xiàn)：CLD組IL-6、IL-13、G-CSF、MCP-1、TNF-α的中位數(shù)及IL-8、IL-10的均數(shù)比對照組高,IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、IL-1β、IL-5、IL-12的中位數(shù)比對照組低。 結(jié)論 1、CLD患兒MIP-1β較對照組顯著降低,我們推測其可能參與了CLD的發(fā)病過程,但具體機制尚不明確。 2、全身免疫因素在慢性肺疾病的非急性期可能不起關(guān)鍵作用,研究慢性肺疾病非急性期的全身性免疫機制的意義可能需要進一步商榷。 3、GM-CSF、IL-7、IL-4、IL-13、IL-17、G-CSF, IFN-γ,IL-5, IL-12可能在全血中未分泌或分泌極少,這可能和早產(chǎn)兒的細(xì)胞免疫及體液免疫不成熟,分泌這些因子的能力相對不足有關(guān)。 4、CLD組IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、G-CSF、MCP-1、TNF-α的濃度有比對照組高的趨勢,IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、IL-1β、IL-5、IL-12的濃度有比對照組低的趨勢,但兩組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義,此結(jié)果是否與樣本數(shù)量不足有關(guān),有待進一步研究。 由于標(biāo)本的難取得性,我們樣本量偏小,所得結(jié)論的準(zhǔn)確性可能需要進一步考證。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R725.6

【參考文獻】

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本文編號：2627864