【摘要】： 研究背景 缺氧缺血性腦病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是新生兒期常見的疾病,是導致新生兒死亡和遠期神經系統(tǒng)發(fā)育障礙的重要因素。由于其發(fā)病機制尚不明確,對其損傷后的治療仍無有力措施。探討發(fā)病機制并在其關鍵分子上進行有效干預,對于改善HIE預后,提高人口質量具有重要意義。 托吡酯(topiramate,TPM),是一種高效新型抗癲癇藥,大量實驗表明其在腦損傷后腦保護中發(fā)揮著重要作用。越來越多的研究表明托吡酯在保護缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)發(fā)揮著重要的作用,未來有可能用于臨床治療HIBD。但是關于托吡酯腦保護作用的具體機制、給藥劑量及藥物副作用等目前研究較少。 膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)是TGF-β超家族的一個新亞族成員,發(fā)揮著多效能的神經營養(yǎng)作用,并且在改善和促進損傷后的神經元修復和再生中發(fā)揮著重要作用。腦缺氧缺血可能是腦內GDNF分泌增加的啟動因素之一,本課題組前期通過對7日齡的Wistar大鼠研究發(fā)現(xiàn),HIBD假手術組偶見GDNF表達;單純缺氧缺血組GDNF于缺氧缺血后12h開始上升,第2d進一步升高,第3d達高峰,第5d有所回落。 有研究表明,星形膠質細胞除了表達Na~+和Ca~(2+)通道以外,GluR及GABAR在其細胞膜表明亦有表達,鑒于托吡酯具有抑制Na~+或/和Ca~(2+)通道激活以及調節(jié)腦內GluR及GABA平衡之功效。因此,我們推測托吡酯有可能通過作用于星形膠質細胞表達的相應受體,達到保護星形膠質細胞,促進GDNF的分泌,進而起到保護神經元的作用。本課題組的前期研究已證實這一點,我們的研究顯示:不同時間托吡酯給藥后觀察組GDNF的分泌量具有差異性。 本課題組前期研究已證明托吡酯用于HIBD的治療時間窗較短,為缺氧缺血后2h之內,且預防用藥優(yōu)于損傷后用藥;托吡酯的腦保護作用與GDNF的分泌增加有直接關系。許多動物實驗研究顯示托吡酯對腦缺血有明顯的治療作用,劑量多在50mg/kg-200mg/kg之間,并未產生損傷邊緣系統(tǒng)及影響骨骼發(fā)育等副作用。本課題通過建立HIBD動物模型,借助觀察腦損傷后給予不同劑量托吡酯對腦組織病理學改變、GDNF動態(tài)表達水平等方面的影響,進一步探討托吡酯腦保護作用的機制、用藥劑量,為托吡酯臨床治療HIE提供強有力的理論和試驗依據(jù),為HIE的治療開辟一條新的道路。 目的 1.觀察新生大鼠各處理組相同時間點腦組織的病理學改變。 2.觀察新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后GDNF表達水平的動態(tài)變化及不同劑量托吡酯干預對GDNF表達的影響。 3.探討托吡酯腦保護作用的機制。 方法 1.120只新生7日齡Wistar大鼠隨機分為假手術組、單純缺氧缺血組及托吡酯治療組,托吡酯治療組根據(jù)不同給藥劑量分為50mg/kg、100mg/kg及150mg/kg治療組。 2.建立HIBD動物模型。 3.給藥及處理方法 (1)托吡酯治療組:將托吡酯溶于注射用水配成2%溶液,采用小型灌胃器灌胃。不同劑量托吡酯治療組分別于手術前30min給予1次、HIBD模型建成后即刻給予1次、之后每隔12h各一次,直至第5d。 (2)單純缺氧缺血組和假手術組同一時間點給予等體積的生理鹽水。 (3)各組均在缺氧缺血后12h、2d、3d、5d分別處死1/4的動物。 4.應用HE染色、免疫組織化學(Immunocytochemistry)及Western Blotting等試驗方法,觀察和測定研究指標。 結果 1.HE染色結果假手術組腦組織結構層次清晰,細胞輪廓清楚,核居中,尼氏體位于核周邊;單純缺氧缺血組在缺氧缺血后12h缺血側皮質、紋狀體出現(xiàn)輕微的病理變化,第2d病變最嚴重,表現(xiàn)為皮質、紋狀體、海馬、丘腦大片壞死區(qū),第3d病變減輕,出現(xiàn)膠質細胞增生,第5d基本上未見破裂細胞,出現(xiàn)大片膠質瘢痕;50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治療組術后12h上述部位病變不明顯,第2d出現(xiàn)輕微病變,表現(xiàn)為極少數(shù)細胞間隙增寬,細胞核濃縮,第3d、5d未見明顯病灶;其中150mg/kg托吡酯治療組腦損傷減輕程度較100mg/kg托吡酯治療組明顯,而100mg/kg托吡酯治療組又優(yōu)于50mg/kg托吡酯治療組,50mg/kg托吡酯治療組較單純缺氧缺血組腦損傷程度減輕。 2.免疫組織化學假手術組僅見較少的GDNF陽性細胞表達,著色較淺,稀疏地分布于整個大腦皮質、紋狀體、海馬,雙側對稱,各時間點上檢測未見明顯的動態(tài)變化;單純缺氧缺血組和托吡酯各治療組非缺血側GDNF陽性細胞染色的程度、數(shù)量及變化情況均類似于假手術組;單純缺氧缺血組缺血側皮質GDNF陽性細胞在損傷后12h開始表達,第2d進一步上升,第3d達高峰,第5d基本恢復正常,僅見極少量的GDNF表達;50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治療組缺血側皮質在損傷后12h即可見較多GDNF表達,第2d進一步增加,第3d達高峰,第5d有所減少,但還可見較多的表達,且150mg/kg托吡酯治療組GDNF的表達尤為明顯,托吡酯治療組在每個時間點上GDNF的表達均明顯高于單純缺氧缺血組(P＜0.05)。GDNF的表達增加與托吡酯成劑量正相關,有統(tǒng)計學意義(各時相點相比均P＜0.05)。 3.Western blotting單純缺氧缺血組與托吡酯各處理組均有GDNF蛋白表達條帶,150mg/kg托吡酯治療組蛋白表達明顯高于單純缺氧缺血組,100mg/kg托吡酯治療組稍弱,50mg/kg托吡酯治療組較差。應用生物凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(Alphaimager2200)掃描定量,通過計算出各組蛋白表達的相對積分值作出蛋白的相對含量,經過統(tǒng)計學處理發(fā)現(xiàn):50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治療組各時間點上蛋白表達均高于單純缺氧缺血組,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);GDNF的表達增加與托吡酯成劑量正相關,有統(tǒng)計學意義(各時相點相比P均＜0.05)。 結論 1.托吡酯可以明顯減輕缺氧缺血導致的腦細胞水腫、液化、壞死,發(fā)揮較好的腦保護作用,托吡酯對神經元的保護作用呈劑量正相關。 2.托吡酯可使缺氧缺血性腦損傷后GDNF表達升高,其表達升高程度與托吡酯呈劑量正相關。 3.增加膠質細胞分泌GDNF可能是托吡酯腦保護作用機制之一。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R722.1

【參考文獻】

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本文編號：2607258