【摘要】： 實(shí)施體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)心臟直視手術(shù)的患者在經(jīng)歷了手術(shù)中的全心缺血-再灌注損傷之后,T_3血清水平可顯著降低。這種情況在小兒患者中尤為常見(jiàn)。研究發(fā)現(xiàn),在實(shí)施CPB心臟直視手術(shù)的全部小兒,手術(shù)后均出現(xiàn)了T_3和T_4血清水平降低,即Ⅱ型正常甲狀腺病態(tài)綜合征(euthyroid sick syndrome,ESS),并可對(duì)小兒的預(yù)后造成不利影響。 目前針對(duì)手術(shù)后ESS的主要治療措施是:在手術(shù)后發(fā)現(xiàn)患者的甲狀腺激素血清水平降低后,通過(guò)補(bǔ)充性應(yīng)用外源性甲狀腺激素使其血清水平恢復(fù)到正常范圍。但是,手術(shù)后補(bǔ)充性應(yīng)用外源性甲狀腺激素不能保證對(duì)ESS獲得一致的滿(mǎn)意治療效果,并有可能對(duì)患者CPB心臟直視手術(shù)后已發(fā)生紊亂的內(nèi)環(huán)境造成進(jìn)一步的干擾,不利于患者的康復(fù)。另外,通過(guò)手術(shù)后補(bǔ)充性應(yīng)用外源性甲狀腺激素使其血清水平恢復(fù)到正常范圍亦有可能消除ESS對(duì)機(jī)體的有益作用。 已有研究證實(shí),甲狀腺激素具有明確的心肌保護(hù)作用。有鑒于手術(shù)后補(bǔ)充性應(yīng)用外源性甲狀腺激素的種種不良影響,我們?cè)O(shè)想如果在小兒CPB心臟直視手術(shù)前預(yù)先應(yīng)用外源性甲狀腺素,不僅可通過(guò)促使心肌組織肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)α和熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)表達(dá)增強(qiáng)來(lái)發(fā)揮抗缺血-再灌注損傷的心肌保護(hù)作用,而且可避免手術(shù)后補(bǔ)充性應(yīng)用外源性甲狀腺素所致的不良影響。但是,目前尚無(wú)在小兒CPB心臟手術(shù)前應(yīng)用外源性甲狀腺激素進(jìn)行手術(shù)中心肌缺血-再灌注損傷保護(hù)和手術(shù)后ESS預(yù)防的研究報(bào)道。 為此,我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究,其內(nèi)容包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)兩部分。目的在于明確預(yù)先應(yīng)用外源性甲狀腺激素是否對(duì)心肌缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用,并探討其心肌保護(hù)的相關(guān)機(jī)制。旨在為今后臨床工作中應(yīng)用這一簡(jiǎn)單的心肌保護(hù)干預(yù)措施提供有價(jià)值的理論依據(jù)。其中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)包括三方面的內(nèi)容。 第一部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 一、預(yù)先應(yīng)用不同劑量左旋甲狀腺素鈉對(duì)心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用 采用未成年健康雌性Wistar大鼠(鼠齡35天)48只,稱(chēng)重后隨機(jī)平均分為六組(每組8只):空白對(duì)照組(BC組)、對(duì)照組(C組)、10μg組、20μg組、40μg組和80μg組。BC組和C組大鼠在實(shí)驗(yàn)前采用普通飼料喂養(yǎng)7天;10μg組、20μg組、40μg組和80μg組大鼠在實(shí)驗(yàn)前除了采用普通飼料喂養(yǎng)7天之外,每天還通過(guò)灌胃方式分別應(yīng)用左旋甲狀腺素鈉(levothyroxine-sodium,L)10μg/100g體重、20μg/100g體重、40μg/100g和80μg/100g體重進(jìn)行預(yù)處理。第8天對(duì)大鼠再次稱(chēng)重,并抽取外周靜脈血檢測(cè)甲狀腺激素血清水平。大鼠麻醉后將其心臟取出,采用Langendorff裝置建立離體心臟缺血-再灌注模型,BC組心臟持續(xù)灌注80 min而不實(shí)施停灌注,其他各組的心臟均順序經(jīng)歷平衡30 min、常溫停灌注20 min和再灌注30 min的處理過(guò)程。實(shí)驗(yàn)中連續(xù)監(jiān)測(cè)心率、收縮壓、±dp/dt_(max)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo);測(cè)定平衡10 min和再灌注10 min時(shí)的冠脈流量;再灌注15 min時(shí)收集冠脈流出液測(cè)定肌酸激酶心肌型同工酶(myocardial-bound creatine kinase,CK-MB)活性;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取心室肌標(biāo)本,采用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)HSP70表達(dá),采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)MHC和甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor,TR)mRNA表達(dá)。 結(jié)果顯示,與BC組和C組比較,20μg組、40μg組和80μg組實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的大鼠的體重均顯著減輕。并且40μg組和80μg組實(shí)驗(yàn)當(dāng)天大鼠的體重均顯著低于10μg組。與BC組和C組比較,20μg組、40μg組和80μg組實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的甲狀腺激素血清水平均顯著升高。10μg組、20μg組、40μg組和80μg組的甲狀腺激素血清水平隨左旋甲狀腺素鈉的用量增加而升高,其中80μg組的甲狀腺激素血清水平顯著高于10μg組、20μg組和40μg組。 與BC組和C組比較,10μg組、20μg組、40μg組和80μg組心率和dp/dt_(max)的基礎(chǔ)值均顯著升高。80μg組收縮壓和-dp/dt_(max)基礎(chǔ)值均顯著高于10μg組和20μg組。 與BC組比較,40μg組和80μg組再灌注期的心率恢復(fù)率均顯著降低,10μg組、20μg組、40μg組和80μg組再灌注期的收縮壓和±dp/dt_(max)恢復(fù)率均顯著降低;與C組比較,10μg組、20μg組、40μg組和80μg組再灌注期的心率和dp/dt_(max)恢復(fù)率均顯著升高,10μg組在再灌注20 min和30 min時(shí)以及20μg組在再灌注30 min時(shí)的收縮壓恢復(fù)率均顯著升高,10μg組、20μg組和40μg組整個(gè)再灌注期和80μg組再灌注30min時(shí)的-dp/dt_(max)恢復(fù)率均顯著升高。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間比較,80μg組再灌注30 min時(shí)的收縮壓恢復(fù)率低于10μg組;40μg組和80μg組再灌注30 min時(shí)的±dp/dt_(max)恢復(fù)率顯著低于10μg組和20μg組。 與BC組和C組比較,10μg組、20μg組、40μg組和80μg組平衡期和再灌注期的冠脈流量均顯著增加。 與BC組比較,10μg組、20μg組、40μg組和80μg組再灌注期冠脈流出液中的CK-MB活性均顯著升高;與C組比較,10μg組、20μg組和40μg組再灌注期冠脈流出液中的CK-MB活性均顯著降低。在四個(gè)實(shí)驗(yàn)組,再灌注期冠脈流出液中的CK-MB活性隨左旋甲狀腺素鈉用量增加而升高,其中80μg組顯著高于10μg組、20μg組和40μg組。 四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的心室肌組織HSP70表達(dá)均顯著強(qiáng)于BC組和C組。10μg組和20μg組的心室肌組織HSP70表達(dá)均顯著強(qiáng)于40μg組和80μg組。 與BC組和C組比較,四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的心室肌組織MHCαmRNA表達(dá)均顯著升高,并且20μg組、40μg組和80μg組的心室肌組織TRα1 mRNA表達(dá)均顯著升高。但是,心室肌組織MHCαmRNA和TRα1 mRNA表達(dá)在四個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間比較均無(wú)顯著差異。 二、芬太尼和舒芬太尼對(duì)預(yù)先應(yīng)用左旋甲狀腺素鈉心肌保護(hù)作用的影響 采用未成年的健康雌性Wistar大鼠(鼠齡35天)56只,隨機(jī)分為七組(每組8只):空白對(duì)照組(BC組)、對(duì)照組(C組)、左旋甲狀腺素鈉10μg組(10μg組)、芬太尼組(F組)、舒芬太尼組(S組)、芬太尼加左旋甲狀腺素鈉組(F+L組)和舒芬太尼加左旋甲狀腺素鈉組(S+L組)。BC組、C組、F組和S組大鼠在實(shí)驗(yàn)前采用普通飼料喂養(yǎng)7天;10μg組、F+L組和S+L組大鼠除了在實(shí)驗(yàn)前采用普通飼料喂養(yǎng)7天之外,每天還通過(guò)灌胃方式應(yīng)用左旋甲狀腺素鈉10μg/100g體重進(jìn)行預(yù)處理。第8天大鼠麻醉后將其心臟取出,采用Langendorff裝置建立離體心臟缺血-再灌注模型,BC組心臟持續(xù)灌注80 min而不實(shí)施停灌注,其他各組心臟均順序經(jīng)歷平衡30 min、常溫停灌注20 min和再灌注30 min的處理過(guò)程。其中F組和F+L組采用含芬太尼30μg/L的KH液灌注,S組和S+L組采用含舒芬太尼3μg/L的KH液灌注,其余各組采用KH液灌注。實(shí)驗(yàn)中連續(xù)監(jiān)測(cè)心率、收縮壓、±dp/dt_(max)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo);測(cè)定平衡10 min和再灌注10 min時(shí)的冠脈流量;再灌注15 min時(shí)收集冠脈流出液測(cè)定CK-MB活性;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取大鼠心室肌標(biāo)本,采用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)HSP70表達(dá),采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)MHC和TR mRNA表達(dá)。 結(jié)果顯示,七組心率和收縮壓的基礎(chǔ)值均無(wú)顯著差異;10μg組、F+L組和S+L組±dp/dt_(max)的基礎(chǔ)值均顯著高于BC組、C組、F組和S組。 與BC組比較,F組和S組再灌注期全部的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均顯著降低;與C組比較,10μg組、F+L組和S+L組再灌注期全部的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均顯著升高;與F組和S組比較,10μg組、F+L組和S+L組再灌注期全部的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均顯著升高。但是,再灌注期全部的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)在10μg組、F+L組和S+L組之間比較均無(wú)顯著差異。 10μg組、F+L組和S+L組平衡期和再灌注期的冠脈流量均顯著高于C組、F組和S組。但是,平衡期和再灌注期的冠脈流量在10μg組、F+L組和S+L組之間比較均無(wú)顯著差異。 10μg組、F+L組和S+L組再灌注期冠脈流出液中的CK-MB活性均顯著高于BC組,但均顯著低于C組、F組和S組。再灌注期冠脈流出液中的CK-MB活性在10μg組、F+L組和S+L組之間比較均無(wú)顯著差異。 10μg組、F+L組和S+L組的心室肌組織HSP70表達(dá)均顯著強(qiáng)于BC組、C組、F組和S組。但是,心室肌組織HSP70表達(dá)在10μg組、F+L組和S+L組之間比較均無(wú)顯著差異。 10μg組、F+L組和S+L組的心室肌組織MHCαmRNA表達(dá)均顯著高于C組、F組和S組。但是,心室肌組織MHCαmRNA表達(dá)在10μg組、F+L組和S+L組之間比較均無(wú)顯著差異。另外,心室肌組織TRα1 mRNA表達(dá)在所有各組之間比較均無(wú)顯著差異。 三、線(xiàn)粒體ATP敏感性鉀離子通道與預(yù)先應(yīng)用左旋甲狀腺素鈉心肌保護(hù)作用的關(guān)系 采用未成年的雌性健康Wistar大鼠(鼠齡35天)32只,隨機(jī)分為四組(每組8只):空白對(duì)照組(BC組)、對(duì)照組(C組)、左旋甲狀腺素鈉10μg組(10μg組)和格列本脲加左旋甲狀腺素鈉組(G+L組)。BC組和C組大鼠在實(shí)驗(yàn)前采用普通飼料喂養(yǎng)7天;10μg組和G+L組大鼠除了采用普通飼料喂養(yǎng)7天之外,每天還通過(guò)灌胃方式應(yīng)用左旋甲狀腺素鈉10μg/100g體重進(jìn)行預(yù)處理。第8天大鼠麻醉后將其心臟取出,采用Langendorff裝置建立離體心臟缺血-再灌注模型,BC組心臟持續(xù)灌注80 min而不實(shí)施停灌注,其他各組心臟均順序經(jīng)歷平衡30 min、常溫停灌注20 min和再灌注30 min的處理過(guò)程,其中G+L組采用含有格列本脲30μmol/L的KH液灌注,其余各組采用KH液灌注。實(shí)驗(yàn)中連續(xù)監(jiān)測(cè)心率、收縮壓、±dp/dt_(max)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo);測(cè)定平衡10 min時(shí)和再灌注10 min時(shí)的冠脈流量;再灌注15 min時(shí)的收集冠脈流出液測(cè)定CK-MB活性;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取大鼠心室肌標(biāo)本,采用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)HSP70表達(dá),采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)MHC和TR mRNA表達(dá)。 結(jié)果顯示,四組心率和收縮壓的基礎(chǔ)值均無(wú)顯著差異;10μg組和G+L組±dp/dt_(max)的基礎(chǔ)值均顯著高于BC組和C組。 與C組比較,10μg組和G+L組再灌注期全部的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均顯著升高;但是,再灌注期全部的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)在10μg組和G+L組之間比較均無(wú)顯著差異。 10μg組和G+L組平衡期和再灌注期的冠脈流量均顯著高于C組,并且10μg組和G+L組平衡期的冠脈流量均顯著高于BC組。但是,平衡期和再灌注期的冠脈流量在10μg組和G+L組之間比較均無(wú)顯著差異。 10μg組和G+L組再灌注期冠脈流出液中的CK-MB活性均顯著高于BC組,但是均顯著低于C組。再灌注期冠脈流出液中的CK-MB活性在10μg組和G+L組之間比較無(wú)顯著差異。 10μg組和G+L組的心室肌組織HSP70表達(dá)均顯著強(qiáng)于BC組和C組。但是,心室肌組織HSP70表達(dá)在10μg組和G+L組之間比較無(wú)顯著差異。 10μg組和G+L組的心室肌組織MHCαmRNA表達(dá)均顯著高于BC組和C組。但是,心室肌組織MHCαmRNA表達(dá)量在10μg組和G+L組之間比較無(wú)顯著差異。另外,心室肌組織TRα1 mRNA表達(dá)在四組之間比較均無(wú)顯著差異。 通過(guò)上述三個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們得出以下結(jié)論: 1.預(yù)先應(yīng)用小劑量左旋甲狀腺素鈉可對(duì)心肌缺血-再灌注損傷產(chǎn)生明確的保護(hù)作用,但是應(yīng)用較大劑量的左旋甲狀腺素鈉可減弱其心肌保護(hù)作用,而且可導(dǎo)致高甲狀腺素血癥。 2.在本實(shí)驗(yàn)所采用的四個(gè)左旋甲狀腺素鈉劑量中,以10μg/100g體重的心肌保護(hù)作用最佳,而且不導(dǎo)致高甲狀腺素血癥的發(fā)生。 3.預(yù)先應(yīng)用左旋甲狀腺素鈉的心肌保護(hù)作用可能是與心肌組織HSP70和MHCαmRNA表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。 4.芬太尼和舒芬太尼對(duì)預(yù)先應(yīng)用左旋甲狀腺素鈉的心肌保護(hù)作用無(wú)影響。 5.線(xiàn)粒體ATP敏感性鉀離子通道可能與預(yù)先應(yīng)用左旋甲狀腺素鈉的心肌保護(hù)作用機(jī)制無(wú)關(guān)。 第二部分臨床試驗(yàn)部分:小兒體外循環(huán)心臟直視手術(shù)前應(yīng)用小劑量甲狀腺素片的心肌保護(hù)作用 本臨床試驗(yàn)共包括40例年齡3～12歲、擬在CPB下實(shí)施擇期簡(jiǎn)單先天性心臟病(房間隔缺損、室間隔缺損、卵圓孔未閉和動(dòng)脈導(dǎo)管未閉)矯正手術(shù)的小兒,將小兒隨機(jī)平均分為兩組(每組20例):對(duì)照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組小兒在手術(shù)前每天按0.4mg/kg體重口服甲狀腺素片,共4天;對(duì)照組小兒手術(shù)前不服用此藥。所有小兒的圍手術(shù)期處理嚴(yán)格按照醫(yī)院操作常規(guī)進(jìn)行。檢測(cè)小兒入院時(shí)、麻醉前以及手術(shù)后第1天、第2天、第4天的甲狀腺激素血清水平變化,并在小兒入院時(shí)、手術(shù)后即刻以及手術(shù)后第1天和第2天觀(guān)察并記錄小兒的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),記錄小兒保留氣管插管時(shí)間、ICU停留時(shí)間以及在ICU中正生性肌力藥物的使用情況。 在手術(shù)結(jié)束前,每組隨機(jī)選取6例小兒留取右心房肌肉標(biāo)本,采用western-blotting技術(shù)檢測(cè)心房肌組織HSP70表達(dá),采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)心房肌組織TR和MHC mRNA表達(dá)。在手術(shù)后24h時(shí)取血,采用AXSYM全自動(dòng)免疫分析儀定量測(cè)定CK-MB血清活性,定性檢測(cè)肌鈣蛋白Ⅰ(troponinⅠ,TnⅠ)的陽(yáng)性率。 結(jié)果顯示,與入院時(shí)的基礎(chǔ)值比較,對(duì)照組手術(shù)后第1天、第2天和第4天的T_3和FT_3血清水平以及手術(shù)后第1天的TSH、T_4和FT_4血清水平均顯著降低。與入院時(shí)的基礎(chǔ)值比較,試驗(yàn)組手術(shù)后第1天、第2天和第4天的T_3和FT_3血清水平以及手術(shù)后第1天的TSH血清水平均顯著降低。 與對(duì)照組比較,試驗(yàn)組手術(shù)后第1天和第2天的T_3、FT_3和T_4血清水平以及手術(shù)后第1天的FT_4血清水平均顯著升高。 與對(duì)照組比較,試驗(yàn)組的正性肌力藥物使用率、CK-MB血清活性、TnⅠ血清陽(yáng)性率和心房肌組織MHCβmRNA表達(dá)均顯著降低,心房肌組織HSP70和MHCαmRNA表達(dá)均顯著增強(qiáng)。 根據(jù)本臨床試驗(yàn)的結(jié)果,我們得出以下結(jié)論: 1.在CPB下實(shí)施簡(jiǎn)單先天性心臟病矯正手術(shù)的小兒,手術(shù)后可發(fā)生Ⅱ型ESS。 2.雖然小兒CPB心臟直視手術(shù)前短期補(bǔ)充性應(yīng)用小劑量甲狀腺素片可減小手術(shù)后甲狀腺激素血清水平降低的嚴(yán)重程度,并預(yù)防Ⅱ型ESS的發(fā)生,但是小兒手術(shù)后仍可發(fā)生Ⅰ型ESS。 3.小兒CPB心臟直視手術(shù)前短期補(bǔ)充小劑量甲狀腺素片具有明確心肌保護(hù)作用,并且手術(shù)前短期補(bǔ)充應(yīng)用小劑量甲狀腺素片的心肌保護(hù)作用可能與甲狀腺激素調(diào)控心肌組織HSP70和MHCαmRNA表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。
【圖文】：

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士畢業(yè)論文附圖圖1一1一1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖空白對(duì)照組對(duì)照組正正常飼料喂養(yǎng)7天 天攢黔黔料 :::澳 澳澳襲簍激蓉繃彩賽舞舞8880陣幾009休重的潤(rùn)灌胃了天 天圖1一2一1實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1的分組和操作流程 130

基礎(chǔ)值再灌10min再灌ZOmin再灌30min時(shí)間圖1一2一3各組再灌注后心率恢復(fù)率的比較(n=8)注:與空白對(duì)照組相比，#P<0.05;與對(duì)照組相比，*稱(chēng)0.05。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R726.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2600016