【摘要】：目的:在過去幾年的臨床工作中發(fā)現了多個不相干的家系的嬰兒中,由于IER3IP1(立即早期反應3相互作用蛋白1)基因常染色體純合子突變,而患上一種名為MEDS綜合癥的疾病,這種病表現包括新生兒糖尿病癥狀,同時伴有小腦癥、減化旋轉、癲癇等神經系統疾病,從而引起了人們對此蛋白的重視。目前對于IER3IP1功能的研究,主要歸納為兩點:1、當內質網不能維持穩(wěn)態(tài)時會造成內質網應激,內質網應激激活未折疊蛋白反應(UPR)試圖恢復穩(wěn)態(tài),而IER3IP1缺乏會抑制了UPR反應,導致內質網應激無法控制;2、IER3IP1與酵母菌中的yos1p蛋白同源,yos1p協同copII(外套蛋白),參與了分泌蛋白由內質網轉運到高爾基體的過程,所以推斷IER3IP1可能也有同樣的功能。本實驗主要從IER3IP1引起新生兒糖尿病入手,關注其對胰島素前體的生物合成以及對內質網穩(wěn)態(tài)和質量控制系統的影響。由于既往對IER3IP1文章的報道較少,首先我們確定IER3IP1在人類,大鼠以及小鼠物種中的高度保守性。其次,研究IER3IP1對胰島素前體的生物合成的作用。再次,由于IER3IP1定位于內質網中,所以可以推測IER3IP1可能作用于內質網質量控制系統,所以本實驗預檢測其對內質網相關降解途徑的作用以及檢測內質網應激相關指標。本研究根據以上推測,設計實驗方案。方法:首先,為了證明IER3IP1基因在各物種中的高度保守,分別根據小鼠和大鼠PUNMED網頁中提供的IER3IP1 cDNA設計引物,提取INS-1細胞(大鼠胰島細胞)和MIN6細胞(小鼠胰島細胞)的mRNA,逆轉錄為cDNA,分別用兩種引物利用PCR技術擴增cDNA,跑DNA膠找到相應堿基位置的條帶,切膠并回收,提取DNA送測序。第二,利用Crispr-CAS9技術將HEK293T細胞中的IER3IP1基因敲除,通過western blotting檢測IER3IP1蛋白水平,驗證敲除成功。第三,分別將野生型HEK293T細胞和IER3IP1細胞中轉染信號肽R6C突變的(胰島素原信號肽第六位由精氨酸突變成半胱氨酸,影響了前胰島素原進入內質網的效率)胰島素原前體質粒,觀察胰島素原前體和胰島素原在兩種細胞中的比例。第四,分別在野生型HEK293T細胞以及IER3IP1~(-/-)HEK293T細胞中分別轉入野生型胰島素原質粒,1)分別收集細胞和上清中的蛋白,比較每組細胞內和上清中胰島素原的比例。2)將收集到的細胞蛋白取出相同的兩份,其中一份加入100nM的DTT,觀察每組形成錯誤折疊蛋白情況。同樣方法轉入野生型帶myc標簽的甲狀旁腺素質粒,觀察IER3IP1是否影響其他分泌蛋白的分泌功能。第五,將野生型HEK293T細胞中分別轉入野生型胰島素原質粒以及Akita質粒,利用免疫共沉淀技術,用自制的胰島素原抗體做免疫沉淀,將免疫沉淀后的蛋白進行western blotting檢測,驗證IER3IP1是否直接結合胰島素原,協助其轉運。第六,將兩種細胞中均轉入Akita突變(胰島素A鏈第七位半胱氨酸突變成酪氨酸)的胰島素原質粒,人為建造一個由于胰島素原錯誤折疊堆積而導致內質網應激的細胞模型,檢查兩種細胞內質網應激相關蛋白的指標,觀察IER3IP1對內質網應激的作用。第七,野生型及IER3IP~(-/-)HEK293T細胞同時轉入Akita突變以及信號肽R6C突變的前胰島素原質粒,轉染24小時候,將每組中細胞平均分成兩個孔,Akita組其中一個孔放線酮(CHX)處理5小時,R6C組處理30分鐘,對每組放線酮處理的細胞和未處理的細胞中的胰島素原的量作對比,觀察Akita胰島素原以及R6C前胰島素原的降解情況。結果:1.通過對大鼠和小鼠IER3IP1 cDNA的測序,并與人類IER3IP1基因進行比對,發(fā)現此基因在物種件具有高度保守性。2.通過crispr-cas9技術,敲除HEK293T細胞中的IER3IP1基因,經western blotting檢測,敲除后細胞中的IER3IP1蛋白水平明顯降低。3.IER3IP1缺失不影響胰島素原前體向內質網的轉位。4.通過對野生型胰島素原和野生型甲狀旁腺素原在HEK293T細胞以及IER3IP1~(-/-)HEK293T細胞中及上清中蛋白量的比對發(fā)現,IER3IP1不僅參與了胰島素的分泌同時也參與了其他分泌蛋白的分泌。5.通過免疫共沉淀方法發(fā)現,IER3IP1既不與野生型胰島素原結合,也不與突變的AKITA直接結合。6.在IER3IP1敲除的HEK293T細胞中,內質網應激相關蛋白表達(BIP、p-EIF2α)較野生型的HEK293T細胞升高,但如果細胞中出現錯誤折疊的胰島素原,其內質網應激相關蛋白表達量較野生型細胞減少7.HEK293T細胞敲除IER3IP1基因后,可使錯誤折疊的Akita胰島素原降解減少,而對于信號肽突變的前胰島素原R6C降解無明顯作用。結論:1.本實驗驗證了IER3IP1在各物種間的高度保守性。2.成功建立了IER3IP1蛋白敲除的HEK293T細胞系。3.IER3IP1敲除后胰島素原分泌減少且胰島素原錯誤折疊堆積,其他分泌蛋白如甲狀旁腺素原蛋白分泌亦減少。4.IER3IP1不直接結合野生型胰島素原和錯誤折疊的胰島素原,并不直接協助分泌蛋白轉運到高爾基體。5.IER3IP1的敲除增加了內質網應激,但當細胞內出現錯誤折疊蛋白時,內質網應激激活程度減低。6.IER3IP1在內質網相關降解通路中發(fā)揮作用,IER3IP1缺失可導致錯誤折疊蛋白降解減慢。但對于沒有進入內質網的蛋白,無明顯作用。說明IER3IP1只與內質網相關降解有關。
【圖文】：

d 上提供的 mouse 及 rat IER3IP1 cDNAecDNA設計的引物擴增出INS-1和MIN顯，而根據 rat cDNA 設計的引物未見敲除的 HEK293T 細胞系/crispr.mit.edu:8079/，，在不同的靶點，共為：ATGGCGTTGACGCAGAGC;TCTGCGTCAACGCCATCGC;GCCATCGCAGTGCTGCACGGCAGCACTGCGATGGCGC4 連接酶連接在酶切的 Cas9 載體質粒上經過改造的 lenticrisprV2 質粒載體轉入細胞系，同時設置未經轉染的細胞作為

.2.1IER3IP1 敲除后的 293T 細胞與野生型 293T 細胞中的 圖 2.2.2IER3IP1 敲除情況定量分析ConIER3IP1-/-050100150***IER3IP1%ConIER3IP1-/-
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R722.1

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本文編號：2594952