【摘要】：背景： 兒童心力衰竭是嚴(yán)重威脅小兒健康的世界性難題。在嬰兒期間,心臟發(fā)育的特點(diǎn)是快速生長(zhǎng)和生理性重構(gòu)。出生后各種原因引起的心臟生長(zhǎng)和重構(gòu)異常導(dǎo)致心臟發(fā)育異常,最終發(fā)展成心力衰竭。蛋白激酶B (protein kinase B, PKB/Akt)信號(hào)通路調(diào)控出生后心臟生長(zhǎng),Akt通過(guò)激活下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex1, mTORC1)控制蛋白質(zhì)合成、能量代謝、凋亡和自噬等重要生命過(guò)程。腦組織富含的Ras同源物1(ras homologue enriched in brain, Rheb1)是mTORC1上游分子,屬于小GTP酶Ras超家族成員。以往主要研究了Rheb1在成年大鼠和小鼠心肌細(xì)胞中的作用。如Rheb1通過(guò)激活mTORC1信號(hào)通路調(diào)控成年大鼠心肌細(xì)胞生理性肥厚過(guò)程。我們課題組前期研究表明,Rheb1通過(guò)mTORC1信號(hào)通路調(diào)控成年小鼠心臟病理性重構(gòu)。關(guān)于Rheb1在出生后(幼年)心臟生長(zhǎng)中的作用尚不清楚。 目的： 探究Rheb1在小鼠出生后心臟生長(zhǎng)及生理性重構(gòu)中的作用。 方法： 通過(guò)心臟特異性基因敲除方法,在小鼠出生后心肌細(xì)胞中敲除Rheb1。通過(guò)大體形態(tài)、組織切片、特殊染色和電鏡,觀察Rheb1心肌特異性敲除小鼠心臟結(jié)構(gòu)的變化,同時(shí)測(cè)量Rheb1敲除小鼠的重要生理參數(shù)體重、心重和心重體重比。通過(guò)離體心臟灌流的方法分離心肌細(xì)胞,觀察Rheb1心肌特異性敲除小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。通過(guò)心臟超聲和心電圖觀察Rheb1敲除對(duì)小鼠心臟功能和電活動(dòng)的影響。通過(guò)蛋白印跡(western blot)、實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)和免疫熒光方法檢測(cè)mTORC1信號(hào)通路、Akt信號(hào)通路、自噬和凋亡標(biāo)記物和代謝相關(guān)基因的變化,對(duì)Rheb1敲除相關(guān)表型的分子機(jī)制進(jìn)行研究。最后通過(guò)進(jìn)一步敲除磷酸酶張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog, Pten)和Aktl改變Akt活性,觀察改變Akt活性變化對(duì)Rheb1敲除小鼠存活的影響。 結(jié)果： 各種基因型小鼠出生比例符合孟德?tīng)栠z傳學(xué)規(guī)律。Rheb1基因在出生后第三天部分敲除,第五至七天完全敲除。Western blot檢測(cè)提示,Rheb1蛋白水平在出生后第七天較對(duì)照組顯著下降。Rheb1敲除小鼠出生后第11天開(kāi)始死亡,第16天全部死亡,中位生存時(shí)間12.5天。正常小鼠心臟重量和心肌細(xì)胞面積隨時(shí)間而增加,Rheb1敲除小鼠心臟重量和心肌細(xì)胞面積第九天開(kāi)始停止增加,心重體重比顯著低于對(duì)照組。麥胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)染色示Rheb1敲除小鼠出生后第9天心肌細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著減少。Rheb1敲除組小鼠體重于死亡前1-2天下降并顯著低于對(duì)照組。與正常對(duì)照組小鼠比較,Rhebl敲除小鼠第十天出現(xiàn)左室射血分?jǐn)?shù)顯著下降和惡性心律失常,左室舒張末內(nèi)徑第12天顯著增大。電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Rheb1敲除小鼠心肌線(xiàn)粒體較對(duì)照組顯著受損�！甌UNEL和凋亡標(biāo)記物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Rheb1敲除小鼠心肌細(xì)胞凋亡較對(duì)照組顯著增加。與對(duì)照組相比,Rheb1敲除組自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅰ水平顯著降低,而LC3Ⅱ水平?jīng)]有相應(yīng)增加。Western blot和qPCR檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,Rheb1敲除組mTORC1下游信號(hào)分子核糖體蛋白6(ribosomal protein6, S6)和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiation factor4E binding protein1,4E-BP1)磷酸化水平顯著下降,代謝相關(guān)基因顯著下調(diào)。進(jìn)一步凋亡相關(guān)信號(hào)分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Rheb1敲除小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物capspasel2、C/EBP同源物蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)、磷酸化c-Jun氮末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、激活作用轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor6, ATF6)和剪切的X盒結(jié)合蛋白-1(spliced X-box binding protein-1, sXBP)較對(duì)照組顯著上調(diào)。與對(duì)照組相比,Rheb1敲除組Akt活性顯著增加。通過(guò)Rheb/Pten雙敲除提高Akt活性可以延長(zhǎng)Rheb1敲除小鼠存活。 結(jié)論： Rheb1是小鼠出生后心臟mTORC1信號(hào)激活所必需,Rheb1通過(guò)激活mTORC1信號(hào)調(diào)控出生后心肌細(xì)胞生長(zhǎng)、能量代謝、存活、心臟功能及電生理穩(wěn)態(tài)。在小鼠出生后心臟中,Rheb1-mTORC1信號(hào)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)存在對(duì)話(huà),調(diào)控出生后心肌細(xì)胞凋亡。Rheb1可能通過(guò)mTORC1依賴(lài)與非mTORC1依賴(lài)的方式調(diào)控出生后心肌細(xì)胞自噬。提高Akt活性有助于改善幼年心衰小鼠存活。
【圖文】：

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)信號(hào)通路洞亡示意圖

圖3-2 Rhebl-mTORCl信號(hào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系示意圖l 代表腦組織富含的 Ras 同源物 1 (Ras homologue enriched in brain 1), mTORCl 代表動(dòng)物雷帕霉素作用IE點(diǎn)蛋白復(fù)合物1 (mammalian target of rapamycin complex 1), ER內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R725.4

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2585641