【摘要】：細(xì)胞重編程技術(shù)的重大突破為研究人類發(fā)育和疾病搭建了新的體外平臺(tái),更為個(gè)體化細(xì)胞治療提供了新的策略,是發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的巨大革新。解決安全性問題是重編程細(xì)胞走向臨床應(yīng)用的前提和關(guān)鍵。本研究利用游離型載體技術(shù)將WAS綜合征(Wiskott-Aldrich Syndrome, WAS)患者的成纖維細(xì)胞重編程為安全的無整合誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cell, iPSCs)。這些WAS特異性iPSCs可在體外誘導(dǎo)分化為血液細(xì)胞,并顯示疾病相關(guān)表型,因此可作為WAS的體外研究平臺(tái)。更為重要的是,我們對(duì)TALEN介導(dǎo)的WAS基因同源重組策略進(jìn)行了優(yōu)化,可對(duì)iPSCs基因組高效編輯,從而得到糾正WAS基因的患者特異性iPSCs本研究將為再生醫(yī)學(xué)替代細(xì)胞iPSCs的安全獲得和安全基因操作提供典范。 第一章WAS綜合征特異性無整合誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞株的建立和鑒定 WAS綜合征是由WAS基因發(fā)生功能缺失型突變所導(dǎo)致的x染色體連鎖的免疫缺陷病。WAS蛋白在血液細(xì)胞中特異性表達(dá)并介導(dǎo)Actin多聚化,是維持正常免疫系統(tǒng)功能不可或缺的重要因子。為建立WAS綜合征的體外研究模型,我們利用表達(dá)OCT3/4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28和TP53shRNA的游離型載體重編程WAS綜合征患者成纖維細(xì)胞。我們所建立的WAS綜合征特異性iPSCs (WAS-iPSCs)在形態(tài)學(xué)與基因表達(dá)模式上均與正常人胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)相似,且表達(dá)完全重編程特異性標(biāo)志Tra-1-60和Tra-1-81。PCR分析和基因測序結(jié)果顯示這些WAS-iPSC克隆不含任何重編程載體DNA殘留,且均攜帶患者WAS基因突變,為安全無整合的iPSCs,可用作體外疾病模擬及后續(xù)基因操作。 第二章WAS-iPSCs體外造血分化及疾病表型鑒定 iPSCs的體外定向分化為研究正常生理發(fā)育及疾病進(jìn)展創(chuàng)造了體外研究平臺(tái)。為了證實(shí)WAS綜合征疾病相關(guān)表型可在體外模擬,我們利用基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)法誘導(dǎo)WAS-iPSCs造血分化。在GM-CSF和M-CSF的作用下,我們從分化體系中成功分離并擴(kuò)增了CD45+CD43+CD11c+造血祖細(xì)胞,后者可在甲基纖維素培養(yǎng)基中分化形成CFU-G、CFU-M和CFU-GM等集落形成單位。為研究成熟免疫細(xì)胞功能,我們利用相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)一步分化得到CD11c+CD14+CD163+巨噬細(xì)胞。我們通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)WAS-iPSCs來源的巨噬細(xì)胞具有抗原攝取與處理能力、吞噬作用、趨化作用等巨噬細(xì)胞經(jīng)典生物學(xué)行為。同時(shí),我們通過免疫熒光染色觀察到WAS-iPSCs來源的巨噬細(xì)胞由于WAS蛋白功能不全所導(dǎo)致的足體結(jié)構(gòu)形成缺陷。綜上,本研究所建立的WAS-iPSCs克隆為研究WAS蛋白在血液免疫系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用提供了理想的體外模型,經(jīng)過基因糾正后,將為WAS綜合征患者的干細(xì)胞基因治療提供無限細(xì)胞來源。 ‘第三章TALEN介導(dǎo)的WAS基因高效靶向編輯 對(duì)患者來源iPSCs的病變基因進(jìn)行安全高效的修復(fù)是個(gè)體化干細(xì)胞基因治療的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN)介導(dǎo)的基因靶向編輯是目前哺乳動(dòng)物基因組改造最有前景的策略之一。但是,TALEN的優(yōu)化設(shè)計(jì)方案、以及TALEN表達(dá)質(zhì)粒與基因編輯模板的細(xì)胞導(dǎo)入方案還沒有很好地建立。因此TALEN介導(dǎo)的基因靶向編輯效率普遍較低。本研究針對(duì)WAS基因6號(hào)內(nèi)含子高突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一系列TALEN組合,并探討了TALEN靶序列和spacer長度對(duì)靶向基因剪切效率的影響,從而優(yōu)化了TALEN的設(shè)計(jì)方案。同時(shí),我們采用整合酶缺陷型慢病毒載體(Integration-defective Lentiviral Vectors, IDLVs)作為基因編輯模板的導(dǎo)入手段,使TALEN介導(dǎo)的靶向基因編輯效率大幅提高。本研究為實(shí)現(xiàn)人iPSCs的高效基因改造提供了新的優(yōu)化策略。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R725.5

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本文編號(hào)：2582021