【摘要】：背景唐氏綜合征(Down's syndrome,DS)是最常見的染色體疾病和出生缺陷,其多余的一條21號(hào)染色體阻礙了兒童的生長(zhǎng)發(fā)育,并且造成嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺陷。DS患者的神經(jīng)功能缺陷不僅會(huì)造成認(rèn)知能力的丟失,還能導(dǎo)致早發(fā)性老年性癡呆的發(fā)生。因此,加強(qiáng)DS神經(jīng)缺陷的研究,對(duì)延緩其腦損傷、改善認(rèn)知能力、提高生活質(zhì)量具有重大的意義。細(xì)胞凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。DS是一種類似于老年性癡呆(Alzheimer disease,AD)的神經(jīng)退行性病變,目前細(xì)胞凋亡對(duì)DS發(fā)生的影響尚未有定論。本研究從蛋白組學(xué)入手,篩選DS小鼠海馬差異蛋白的表達(dá),通過差異蛋白的生物信息學(xué)分析挑選出關(guān)鍵的蛋白分子,從組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)角度探討該分子與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系。本研究將有助于闡明DS神經(jīng)功能缺損的分子機(jī)制。目的(1)以Ts65Dn小鼠作為DS模型,采用iTRAQ技術(shù)篩選鑒定其海馬組織中的差異蛋白表達(dá),為深入研究DS神經(jīng)缺陷的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)；(2)運(yùn)用生物學(xué)信息學(xué)分析,明確差異蛋白的性狀及其相互作用,揭示差異蛋白與DS神經(jīng)缺陷發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性；(3)明確DS海馬神經(jīng)元的凋亡狀態(tài),初步證實(shí)Akt蛋白異常表達(dá)與DS神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系,進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白組學(xué)結(jié)果。方法(1)Ts65Dn小鼠傳代繁殖：用Ts65Dn小鼠作為DS模型,雌雄合籠繁殖子代,以第一代小鼠(16～18周)作為本研究對(duì)象。按照J(rèn)ackson Laboratory推薦采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)小鼠17號(hào)染色體GRCm38.p1突變進(jìn)行子鼠品系的鑒定。(2)應(yīng)用iTRAQ技術(shù)篩選DS小鼠海馬組織的差異蛋白：收集小鼠海馬組織,采用蛋白電泳、蛋白質(zhì)譜的方法進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),證實(shí)樣本蛋白含量符合要求。在此基礎(chǔ)上采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白電泳,之后進(jìn)行酶解和肽段定量；采用iTRAQ 4標(biāo)試劑盒進(jìn)行肽段標(biāo)記；經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析；采用Mascot 2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及鑒定,采用Proteome Discoverer1.3軟件對(duì)肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析。(3)差異蛋白的生物信息學(xué)分析：針對(duì)iTRAQ技術(shù)在Ts65Dn小鼠海馬組織中篩選鑒定到的374個(gè)差異蛋白,分別采用GO功能分析和富集分析、KEGG通路分析、Network網(wǎng)絡(luò)分析、Hub蛋白分析等方法,闡明籌異蛋白的理化特性和生物信息學(xué)特征。(4)Akt蛋白在Ts65Dn小鼠神經(jīng)元凋亡中的作用研究：收集海馬組織,采用透射電鏡直接觀察Ts65Dn小鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的形態(tài)學(xué)改變；采用TUNEL方法觀察Ts65Dn小鼠海馬神經(jīng)元的凋亡比率；分別采用免疫組化技術(shù)與Western blot技術(shù)觀察Ts65Dn小鼠海馬組織Akt蛋白及其磷酸化(p-Akt)的表達(dá)；從新生Ts65Dn小鼠腦組織分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞；采用LY294002抑制Akt蛋白磷酸活化,阻斷PI3K/Akt通路,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況,初步證實(shí)Akt蛋白的異常表達(dá)與Ts65Dn小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系。結(jié)果(1)Ts65Dn母鼠交配繁殖后,第一代子鼠存活17只,按照J(rèn)ackson Laboratory推薦的基因型鑒定方法進(jìn)行型別鑒定。采用iTRAQ技術(shù),經(jīng)Mascot查庫(kù)和Proteome Discoverer定量分析,Ts65Dn小鼠海馬組織中共篩選鑒定到2805種蛋白質(zhì)。通過與正常小鼠比較進(jìn)行顯著性分析并計(jì)算其顯著性指數(shù),共鑒定到顯著性表達(dá)差異的蛋白共374個(gè),其中顯著升高的蛋白有195個(gè),表達(dá)顯著降低的有179個(gè)。(2)利用生物信息學(xué)方法對(duì)差異蛋白進(jìn)分析。其中GO分析發(fā)現(xiàn)：分子功能類別以結(jié)合蛋白(334,89.3%)、催化活性的蛋白質(zhì)(102,27.3%)和轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)(39,10.4%)數(shù)量最多；生物學(xué)途徑以細(xì)胞途徑(238,63.6%)、生物調(diào)節(jié)途徑(149,39.8%)和代謝途徑(148,39.6%)為主；細(xì)胞學(xué)組件大多數(shù)是細(xì)胞質(zhì)、胞外區(qū)、細(xì)胞膜成分。KEGG分析Ts65Dn小鼠海馬中374個(gè)差異蛋白共有143個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)到144個(gè)不同的KEGG通路,經(jīng)FDR矯正取P0.05統(tǒng)計(jì)分析, Akt蛋白所在通路顯著性富集。(3)Ts65Dn小鼠海馬組織神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度的凋亡改變。透射電鏡發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡改變,核膜變薄并輕度下陷、染色體分布不均、核呈固縮性改變、細(xì)胞壁凹陷等。TUNEL結(jié)果顯示Ts65Dn小鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的陽性表現(xiàn)為細(xì)胞漿、細(xì)胞核呈棕黃色,與正常小鼠相比,神經(jīng)元凋亡率顯著增加。(4)免疫組化與Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ts65Dn與正常小鼠中樞神經(jīng)組織錐體細(xì)胞均有Akt蛋白的表達(dá),與正常小鼠相比,Ts65Dn小鼠中Akt蛋白顯著增高,p-Akt蛋白的表達(dá)也顯著增強(qiáng)。從新生Ts65Dn小鼠腦組織成功分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞,進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元,加入LY294002抑制劑培養(yǎng)48h后,Akt磷酸活化被抑制,p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低,神經(jīng)元凋亡率有降低的趨勢(shì)。結(jié)論(1)采用蛋白組學(xué)iTRAQ技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比,Ts65Dn小鼠海馬組織存在大量差異表達(dá)的蛋白(374個(gè)),可能與神經(jīng)缺陷相關(guān)。(2)利用生物信息學(xué)方法從多個(gè)不同的角度分析Ts65Dn小鼠海馬組織差異蛋白的特點(diǎn)、相互作用及其參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),初步揭示了差異蛋白與DS神經(jīng)缺陷的相關(guān)性。(3)Ts65Dn小鼠海馬組織神經(jīng)元呈現(xiàn)出高凋亡狀態(tài),同時(shí)在DS小鼠海馬組織及離體培養(yǎng)的神經(jīng)元中Akt蛋白異常表達(dá),且與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)。
【圖文】：

常見的染色體疾病，也是最常見的遺傳性智力殘疾。英國(guó)隆生Ｌａｎｇ邋Ｄｏｗｎ早在１８８６年逡逑首先對(duì)該病并作了臨床描述，直到１９巧年，人們才證實(shí)此病是由于Ｇ組染色體即２１逡逑號(hào)染色體Ｈ條所致（見圖１）。ＤＳ主耍的發(fā)病機(jī)理為父親或母親減數(shù)分裂形成配子時(shí)發(fā)逡逑生２１號(hào)染色體不分離，，其中８０％是由于形成卵子的減數(shù)分裂過捏中２１號(hào)染色體不分離。逡逑目前認(rèn)為母親高齡是該病發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一，耳環(huán)境污染、病毒感染、放射福射、藥逡逑物濫用等也是造成ＤＳ發(fā)生重要原因。逡逑根據(jù)流行病學(xué)研究，ＤＳ的發(fā)生率大約為１／７００，全球每年約有２０萬例的新增病例逡逑１。據(jù)《中國(guó)出生缺陷防治報(bào)告２０１２》調(diào)查顯示２，我國(guó)ＤＳ發(fā)生率約為１４．７／萬（１化８０），逡逑每年新增２．３萬－２．５萬例。ＤＳ患兒在出生時(shí)即已有明顯的將殊面容，且常呈現(xiàn)嗜睡和喂逡逑養(yǎng)困難。患兒有特殊面容，表現(xiàn)為頭煩小而圓，眼距寬，眼裂小，夕川良角上斜等。智能逡逑低下是其最突出、最嚴(yán)重的表現(xiàn)，大部分ＤＳ患者均有輕至中度智障，智商通常在３０？７０逡逑之間

Ｔｓ６５Ｄｎ小鼠特征為包含一個(gè)額外的易位染色體，該易位染色體主要包括ＭＭＵ１６染逡逑色體遠(yuǎn)端和部分ＭＭＵ１７著絲粒，其含有１３６個(gè)ＨＳＡ２１染色體上的基因，約占整個(gè)人類２１逡逑染色體基因數(shù)的５Ｏ％Ｐ０’２４’２６１邋（見圖１．３）。逡逑Ｍｍｕｌ６邐Ｍｍｕｌ７逡逑？邋’邐Ｌ＿＾ＲＰ２３１４７Ｇ２３．邋Ｓｙ巧ＩＭｂ逡逑ｐ－？Ｄ１７ＭｉｔＳ８，邋＇１０邋４邋Ｍｂ逡逑Ｍｍｕ邋１７？逡逑ｔｎ逡逑Ｏｕ邋１７：？Ｓ邋ｌＯＭｂ逡逑Ｍｒｐ／巧邐＾逡逑■＇ＳＩ邋６邋Ｍｂ逡逑Ｃｈｒ邋地邋＊１３．９邋Ｍｂ逡逑Ｐ＞Ａ１ｒｐ／巧－８４．７邋Ｍｂ邋Ｙ逡逑Ｉ邐Ｉ邐公邐逡逑圖１．３邋Ｔｓ化Ｄｎ小鼠易位染色體示意圖逡逑５逡逑ｆ逡逑
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R725.9

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本文編號(hào)：2554854