【摘要】：研究背景 神經(jīng)管畸形（neural tube defects， NTDs）是最常見、最嚴重的出生缺陷之一。NTDs的發(fā)生是由于囊胚期神經(jīng)管閉合異常所導(dǎo)致的神經(jīng)管開放。在世界范圍內(nèi)，其發(fā)生率僅次于先天性心臟病，而我國的發(fā)生率為全世界最高。除致死性NTDs外，輕型閉合型NTDs不僅將給患兒帶來伴隨終生的先天殘疾及嚴重的心理缺陷，也會給患兒家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。 隨著孕期葉酸（folic acid，F(xiàn)A）補充的推廣，NTDs的流行趨勢明顯下降，但大規(guī)模的研究證實使用FA補充劑后仍有30-50%的NTDs無法預(yù)防。另外過量補充FA還可能引起包括新生兒胰島素抵抗或肥胖在內(nèi)的一系列非治療作用，因此FA補充是否應(yīng)當(dāng)成為強制飲食添加劑，何種劑量為適宜補充劑量，在國際上引起了廣泛的爭議。 除葉酸缺乏外，一線抗癲癇藥物丙戊酸（Valproic acid，VPA）的應(yīng)用也是NTDs的誘因之一。對小鼠模型的研究提示，VPA可能通過FA代謝途徑導(dǎo)致NTDs，并且給予FA補充可能在一定程度上起到保護作用，從而避免NTDs發(fā)生。反對使用VPA的學(xué)者強調(diào)其致畸性對胎兒的嚴重影響，但是對于部分常見癲癇類型VPA仍然是無法替代的最佳選擇。因此很難在妊娠前期或妊娠期更換其他藥物，這使VPA在妊娠期的使用陷入進退兩難的境地。 神經(jīng)管閉合這一過程始于胚胎第20天，且是貫續(xù)發(fā)生的發(fā)育過程，這使以往的觀察研究遇到了很大的困難。同時由于研究對象的特殊性，特別是人類研究存在的倫理問題，使我們無法直接對人類胚胎進行在體實驗。此外由于胚胎發(fā)育的不可逆性，我們亦無法獲知神經(jīng)管畸形的發(fā)生的真實過程，只能通過回顧性分析獲得間接的證據(jù)。這就使動物模型中獲得的信息無法在人類中獲得驗證。因此如何建立一個人類的NTDs體外研究模型，成為亟待解決的問題。 本研究探索利用胚胎干細胞（ES cell）和體細胞來源的誘導(dǎo)多能性干細胞（iPScell）,結(jié)合體外神經(jīng)系定向誘導(dǎo)分化技術(shù)，建立人類干細胞來源神經(jīng)管研究模型。嘗試通過不同組別的藥物作用實驗，了解FA及VPA對神經(jīng)管形成及神經(jīng)系發(fā)育的作用。同時在此基礎(chǔ)上進行藥物濃度篩選的初步應(yīng)用研究，為在人類系統(tǒng)中驗證動物模型中所獲理論創(chuàng)造條件。 第一部分人類多能干細胞來源神經(jīng)管體外模型建立 方法：對人類多能干細胞系H1；H9；iPS4進行培養(yǎng)傳代。同時進行神經(jīng)系分化：去除bFGF，，懸浮培養(yǎng)細胞，誘導(dǎo)EB形成；利用神經(jīng)上皮干細胞（NSC）培養(yǎng)基對EB進行貼壁培養(yǎng)，誘導(dǎo)玫瑰花環(huán)樣神經(jīng)管結(jié)構(gòu)（RS）形成,利用NSC標記物進行免疫熒光染色鑒定；利用定向誘導(dǎo)分化技術(shù)進行進一步分化：缺省分化大腦皮質(zhì)大椎體細胞；腹側(cè)尾側(cè)化脊髓前腳運動神經(jīng)元；神經(jīng)膠質(zhì)細胞系定向誘導(dǎo)分化；神經(jīng)脊系細胞定向誘導(dǎo)分化；對分化獲得細胞進行特異性標記物免疫熒光染色鑒定。 結(jié)果：人類多能干細胞系體外培養(yǎng)傳代后仍表達多能轉(zhuǎn)錄因子Oct4, Nanog；H1；H9；iPS4均能形成EB；三系均能在誘導(dǎo)條件下形成RS結(jié)構(gòu)，且Pax6，Nestin陽性；定向誘導(dǎo)分化：獲得前腦皮質(zhì)大椎體細胞，Pax6陽性；獲得人γ-氨基丁酸能神經(jīng)元，GABA陽性；獲得多巴胺能神經(jīng)元，TH陽性；獲得脊髓前腳運動神經(jīng)元,ChAT陽性；獲得星形膠質(zhì)細胞，GFAP，S100陽性；獲得神經(jīng)脊細胞，P75，Sox10，SMA陽性。 結(jié)論：利用三個人類多能干細胞系，通過定向誘導(dǎo)分化，我們首次提出建立人類干細胞來源神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)模型。此模型可以在發(fā)育時間，細胞構(gòu)成，分化潛能上模擬在體神經(jīng)管的發(fā)育過程。它的建立為后續(xù)藥物濃度篩選提供了條件，為NTDs發(fā)生及預(yù)防機制研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分葉酸缺乏及補充對神經(jīng)管結(jié)構(gòu)形成及神經(jīng)發(fā)育的影響 方法：利用第一部分中建立的人類多能干細胞體外神經(jīng)管分化模型，選擇iPS4作為研究對象，使用無FA的PRIM1640培養(yǎng)基作為空白對照組，根據(jù)FA梯度分組：0.02uM組，0.2uM組，2uM組，20uM組，80uM組，160uM組。在無FA的PRIM1640培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度FA，對iPS4細胞進行分化。分化過程中比較不同F(xiàn)A分組的：EB形成情況；EB中多能標記物Oct4，Nanog和Sox2的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平；RS形成情況；RS中NSCs標記物Pax6及Nestin的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平；遠期神經(jīng)分化率差別；神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化率差別；神經(jīng)脊細胞分化率差別。 結(jié)果：FA缺乏組（0-2uM）：人類誘導(dǎo)多能干細胞分化EB形成率降低（P＜0.05），多能因子表達量下降；RS形成明顯減少（P＜0.05）,結(jié)構(gòu)紊亂；NSCs標記物Pax6，Nestin的mRNA，蛋白質(zhì)表達下調(diào)；遠期神經(jīng)元，神經(jīng)脊分化率呈劑量依賴性降低。FA補充組（20-160uM）：EB形成率升高，多能因子表達量與iPS細胞相似，RS形成數(shù)量增多（P＜0.05），神經(jīng)系標記物表達量上調(diào)，遠期神經(jīng)元及神經(jīng)脊系分化率上升。但在FA補充組中，組間差異均無統(tǒng)計意義。FA缺乏組及FA補充組間神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化率無顯著差別。 結(jié)論：在人類胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)A缺乏或缺失將影響早期神經(jīng)發(fā)育。FA缺乏或缺失將抑制NSCs分化，引起RS形成障礙，進而影響遠期神經(jīng)元及神經(jīng)脊系的分化，最終導(dǎo)致一系列先天缺陷及綜合征。對于FA代謝正常圍孕期女性，補充FA使其維持在正�；蛏愿咚剑�20uM-80uM，即常規(guī)富含F(xiàn)A飲食或400ug/day補充劑量）將有利于神經(jīng)分化及神經(jīng)管的形成，而無需給予更高劑量FA（160uM或600ug/day），帶來不必要的非治療作用。 第三部分VPA及葉酸對神經(jīng)系發(fā)育的影響及其相互作用 方法：利用第一部分中建立的人類多能干細胞體外神經(jīng)管分化模型，選擇iPS4作為研究對象，使用DMEM/F12+N2培養(yǎng)基作為空白對照組，實驗分組：VPA組（1mM VPA），VPA+FA組（1mM VPA+160uM FA）。對不同處理組別的iPS細胞進行神經(jīng)分化，分化過程中比較不同分組的： RS形成情況；RS中NSCs標記物的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平；NSCs殖及凋亡情況；NSCs細胞周期；FA受體Forl在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達情況；及遠期神經(jīng)分化率差別。 結(jié)果：與對照組相比，VPA處理組：RS形成明顯減少（P＜0.01）,結(jié)構(gòu)紊亂；NSCs標記物Pax6，Nestin的mRNA，蛋白質(zhì)表達下調(diào)（P＜0.001）；NSCs增殖減少(41.01±3.53%VS.80.09±4.1%，P＜0.01）；凋亡顯著增多（21.38%VS.3.71%，P＜0.01），凋亡早期細胞亦增高（29.64%VS.9.76%，P＜0.05）；處于G2-S期細胞比例下降（34.75%VS.63.67%，P＜0.05），G0-G1期細胞增多（65.25%vs.36.33%，P＜0.05）；FA受體Forl mRNA及蛋白質(zhì)表達量下調(diào)；遠期神經(jīng)元分化率降低。VPA+FA組：RS形成較VPA單獨處理組增多,但較對照組仍減少（P＜0.05），但RS結(jié)構(gòu)較對照無明顯差別；NSCs標記物Pax6，Nestin mRNA，蛋白質(zhì)表達較VPA組明顯升高（P＜0.01），與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；NSCs增殖較VPA單獨處理組高，但仍低于對照（58.0±4.67%VS.80.09±4.1%，P＜0.05）；與VPA單藥組相比，凋亡稍降低，但差別不具有統(tǒng)計學(xué)意義，與對照組相比，細胞死亡多（15.46%VS.3.71%，P＜0.01），但凋亡早期細胞比例無明顯差別（9.76%VS.9.86%，P＞0.05）；與VPA單獨處理組相比，處于G2-S期細胞比例增多(43.35%VS.34.75%)，G0/G1期的細胞比例減少（56.65%VS.65.25%），但與對照組相比，G0-G1期細胞仍高（56.651%VS.36.34%，P＜0.05）；FA受體Forl的mRNA及蛋白質(zhì)表達量下調(diào)；與對照相比，遠期神經(jīng)元分化率仍降低。 結(jié)論：結(jié)果證實治療劑量的VPA抑制人類多能干細胞的體外神經(jīng)分化。其通過抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，阻礙FA代謝，破壞正常神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致NTDs的發(fā)生，同時影響遠期神經(jīng)分化。補充FA實驗組證明FA在其他致畸誘因的存在下，可以在一定程度上保護早期神經(jīng)胚發(fā)育，彌補細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進FA代謝，但與對照相比仍存在一定異常。這為解決臨床治療存在的矛盾提供了新的研究平臺，在藥物篩選中有著一定的應(yīng)用前景。 創(chuàng)新點與小結(jié) 本課題首次將人類多能干細胞體外神經(jīng)管分化模型應(yīng)用于出生缺陷—NTDs的研究。在建立人類干細胞來源神經(jīng)管體外模型的基礎(chǔ)上，進行了FA濃度篩選及VPA處理等藥物篩選的初步應(yīng)用研究。首次在人類分化發(fā)育系統(tǒng)中驗證了動物模型中所獲得的理論；為后續(xù)制備患者個體化神經(jīng)管分化模型，研究NTDs發(fā)病機制，致病基因篩選，優(yōu)化預(yù)防配方奠定了基礎(chǔ)；在提高人口質(zhì)量，最終避免NTDs發(fā)生的道路上，邁出了新的一步。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R748

【共引文獻】

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本文編號：2484472