【摘要】：肥胖正成為全球關(guān)注的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。隨我國經(jīng)濟快速發(fā)展和人民生活方式改變，肥胖在我國也逐漸呈現(xiàn)流行趨勢。近年來，肥胖兒童檢出率不斷增高、2型糖尿病呈現(xiàn)明顯低齡化趨勢的現(xiàn)象已引起各國兒科學(xué)者的廣泛關(guān)注。我國有關(guān)肥胖兒童、青少年的研究發(fā)現(xiàn)，肥胖兒童中目前診斷為2型糖尿病的人數(shù)盡管不多，但卻普遍存在胰島素抵抗指數(shù)的升高與葡萄糖耐量實驗的異常，而胰島素敏感性降低或胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)生的早期重要事件，因此探討肥胖及肥胖所致胰島素抵抗的發(fā)病機制也已成為兒科研究領(lǐng)域的一個重要研究內(nèi)容。 PID1基因（也稱NYGGF4基因），是本研究小組克隆到的一條人類全長新基因（GenBank登錄號AY317148）。前期研究發(fā)現(xiàn)，該基因差異高表達(dá)于肥胖者網(wǎng)膜脂肪組織中，且在骨骼肌、脂肪、心肌等胰島素作用的靶組織中呈現(xiàn)較高表達(dá)；細(xì)胞水平研究證實，該基因的表達(dá)隨前體脂肪細(xì)胞的分化進程逐漸升高，在成熟脂肪細(xì)胞中表達(dá)最高，其表達(dá)受多種胰島素敏感性相關(guān)因子（如腫瘤壞死因子alpha、白細(xì)胞介素6等）的調(diào)控，提示該基因可能在成熟脂肪細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，且可能與脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的調(diào)節(jié)相關(guān)。進一步研究顯示，PID1能夠通過胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中IRS1-PI3K-AKT信號通路調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞胰島素的敏感性。前期研究均局限于體外水平，為了進一步研究PID1基因?qū)Ψ逝旨耙葝u素敏感性的作用，本文首次構(gòu)建了PID1脂肪組織特異性轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在體進一步探討該基因?qū)π∈蠓逝直硇桶l(fā)生、糖脂代謝及胰島素敏感性的影響，并探討其作用機制。 第一部分PID1脂肪組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建 目的：構(gòu)建PID1脂肪組織特異性表達(dá)載體pL253-aP2-PID1，建立PID1脂肪組織特異性轉(zhuǎn)基因小鼠。 方法： RT-PCR法克隆小鼠PID1基因CDS，把PID1基因插入脂肪組織特異表達(dá)的脂肪蛋白2（ap2）啟動子的下游，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pL253-aP2-PID1。用限制性內(nèi)切酶Pvu1將pL253-aP2-PID1線性化，通過顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體注射到小鼠受精卵原核。PCR檢測轉(zhuǎn)基因首建鼠（founder）的基因型，Western Blot檢測鼠源性PID1基因在轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織中的表達(dá)。 結(jié)果：1）成功構(gòu)建了脂肪組織特異性表達(dá)載體pL253-aP2-PID1；2）建立了2個株的脂肪組織特異表達(dá)PID1轉(zhuǎn)基因小鼠。 結(jié)論：PID1脂肪組織特異性轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建成功。 第二部分PID1脂肪組織特異性轉(zhuǎn)基因小鼠正常飲食下的表型分析 目的：觀察PID1脂肪組織特異性轉(zhuǎn)基因小鼠在正常飲食下的肥胖表型發(fā)生、糖脂代謝變化及胰島素敏感性。 方法：PID1脂肪組織特異性轉(zhuǎn)基因（transgenic mice，TG）小鼠和同年齡、同性別野生型（wild type，WT）小鼠，從出生后21天（斷奶）開始，每兩周稱量體重；HE染色觀察脂肪、肝臟組織形態(tài)學(xué)改變；代謝籠實驗實時監(jiān)測小鼠攝食、產(chǎn)熱、耗氧量、CO2產(chǎn)生、呼吸商、活動等能量代謝和活動能力的變化；采用血液生化指標(biāo)（血糖、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白），評價小鼠的糖脂代謝變化；通過血清胰島素水平、葡萄糖耐量實驗、胰島素耐量實驗，評價小鼠胰島素敏感性的變化。 結(jié)果：1）PID1脂肪組織特異性TG小鼠的體重與對照比較無顯著性差異；HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞的大小也無明顯變化；2）PID1脂肪組織特異性TG小鼠的肝臟脂滴與對照比較無明顯差異；3）PID1脂肪組織特異性TG小鼠與對照比較，攝食、耗氧量、產(chǎn)熱以及CO2產(chǎn)生、呼吸商均無顯著差異；但轉(zhuǎn)基因小鼠的活動能力明顯增加；4）PID1脂肪組織特異性TG小鼠與對照比較，血糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白均無顯著差異；5）PID1脂肪組織特異性TG小鼠與對照比較，血清胰島素水平、葡萄糖耐量實驗和胰島素耐量實驗結(jié)果均無明顯差異。 結(jié)論：PID1脂肪組織特異性TG小鼠與WT小鼠在正常飲食下肥胖表型指標(biāo)、糖脂代謝以及胰島素敏感性均無顯著性變化。 第三部分PID1脂肪組織特異性轉(zhuǎn)基因小鼠高脂飲食誘導(dǎo)下的表型分析 目的：觀察PID1脂肪組織特異性轉(zhuǎn)基因小鼠在高脂飲食誘導(dǎo)下的肥胖表型發(fā)生、糖脂代謝變化及胰島素敏感性，并初步探討這些變化的可能機制。 方法：正常飲食喂養(yǎng)的PID1脂肪組織特異性TG小鼠及同年齡、同性別WT小鼠，出生后2個月（性成熟）后改用高脂飼料喂養(yǎng)，且每周稱量小鼠的體重；采用HE染色觀察脂肪、肝臟組織形態(tài)學(xué)改變；采用血液生化指標(biāo)（血糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、甘油三酯清除率），評價PID1脂肪組織轉(zhuǎn)基因小鼠的糖脂代謝變化；通過血清胰島素水平、葡萄糖耐量實驗、胰島素耐量實驗，評價PID1脂肪組織轉(zhuǎn)基因小鼠胰島素敏感性的變化；Western Blot及免疫熒光分析脂肪組織中IRS1-PI3K-AKT信號通路以及LRP1的變化。 結(jié)果：1）PID1脂肪組織特異性TG小鼠的體重在高脂飲食誘導(dǎo)10周后出現(xiàn)顯著性增高；HE染色結(jié)果顯示TG小鼠脂肪細(xì)胞明顯增大；2）HE染色結(jié)果顯示PID1脂肪組織特異性TG小鼠的肝臟脂滴也顯著增多；3）PID1脂肪組織特異性TG小鼠與對照比較，其血甘油三酯含量顯著增加，血糖、膽固醇、低密度脂蛋白則無顯著差異；4）PID1脂肪組織特異性TG小鼠的甘油三酯清除率顯著降低；5）與對照比較，PID1脂肪組織特異性TG小鼠的血清胰島素水平無明顯差異，但葡萄糖耐量實驗顯示90分鐘時TG小鼠血糖顯著高于WT小鼠，胰島素耐量實驗則在15分鐘時血糖顯著高于WT小鼠；6）Western Blot及免疫熒光分析均顯示，TG小鼠脂肪組織中IRS1-PI3K-AKT信號通路明顯受抑，LRP1的表達(dá)量顯著增加。 結(jié)論：PID1脂肪組織特異性轉(zhuǎn)基因小鼠在高脂飲食誘導(dǎo)下出現(xiàn)肥胖表型，發(fā)生糖脂代謝紊亂、胰島素敏感性降低，其機制可能與PID1基因過表達(dá)顯著抑制了IRS1-PI3K-AKT信號通路有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R723

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2459301