【摘要】：支氣管哮喘(broncahial asthma)簡稱哮喘,是一種常見的呼吸道疾病,其特征為氣道炎癥細胞的存在和氣道結(jié)構(gòu)的改變即“氣道重塑”,可導致不可逆的氣道阻塞、氣道高反應、肺功能下降等。其中,氣道重塑是由于持續(xù)性的炎癥反應和上皮細胞的損傷而導致的,現(xiàn)在已經(jīng)非常清楚氣道重塑可導致難以治療的嚴重哮喘。很多研究表明,支氣管平滑肌細胞(ASMC)在氣道重塑中發(fā)揮著關鍵作用,不僅通過它們的收縮功能,更重要的是,通過很多介質(zhì)作用于哮喘狀態(tài),但其機制尚未確定。目前哮喘的治療主要以控制癥狀為主,故探討哮喘氣道重塑的發(fā)生機制對哮喘的預防與治療具有重大意義。很多研究表明,凝血酶在氣道重塑的過程中起重要的作用。我們通過建立哮喘大鼠模型探討凝血酶活性與哮喘氣道重塑的相關性。我們此研究分為二部分：①凝血酶通過PAR-1激活ERK1/2信號調(diào)控哮喘大鼠氣道重塑；；②哮喘大鼠凝血酶、氣道炎癥、氣道重塑的相關性研究第一部分凝血酶通過PAR-1激活ERK1/2信號調(diào)控哮喘大鼠氣道重塑研究目的氣道重塑是氣流阻塞的原因,是哮喘病理生理變化的核心,其特點是氣道平滑肌肥厚和其他一些變化,包括基底膜增厚、上皮細胞缺失、炎性細胞浸潤,杯狀細胞增生。導致這些變化的確切的介質(zhì)及其調(diào)節(jié)機制目前仍不明確。而氣道重塑對哮喘有非常重要的影響：氣道高反應性、不可逆的氣流受限、哮喘急性發(fā)作甚至導致患者死亡。因此,更深入的研究氣道重塑的機制是非常重要而且必須的。凝血酶是在血液凝固級聯(lián)反應中形成的,除了其蛋白水解作用,凝血酶可以通過激活蛋白酶激活受體啟動許多細胞。而近年來研究表明,凝血酶除了在凝血機制中的中心作用,在氣道炎癥和氣道重塑中亦有重要作用,但具體機制尚不明了。支氣管平滑肌細胞(ASMC)在氣道重塑中具有重要作用。支氣管平滑肌的變化程度與哮喘的嚴重程度相關。已證實ASMC是豐富的促炎癥因子的來源,如細胞因子、趨化因子,并且作用于氣道重塑中的細胞增殖、遷移和炎癥細胞相互作用。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的一條重要的信號傳導途徑,ERK1和ERK2是其中研究最完善的,它們通過磷酸化激活,進而調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡等。pERK1/2為其磷酸化水平,可調(diào)控氣道平滑肌細胞的異常增殖和分泌細胞因子,參與氣道重塑。蛋白酶活化受體-1(PAR-1)是一個G-耦合的、可以被絲氨酸蛋白酶(如凝血酶)激活的膜蛋白。其原名凝血酶受體,當凝血酶切割其氨基酸端的特定位置時被激活。PARs分布廣泛,其中PAR-1可表達在所有類型的細胞中。在呼吸系統(tǒng)中,PAR-1表達在上皮細胞和平滑肌細胞。因此,我們提出了一個假設,即凝血酶通過PAR-1激活ERK1/2信號通路,進而參與哮喘大鼠氣道重塑。研究方法將36只雌性大鼠隨機分為6組,正常對照組(SAL組)、哮喘模型組(OVA+SAL組)、凝血酶組(OVA+thrombin組)、水蛭素組(OVA+hirudin組)、凝血酶+PERK1/2抑制劑PD98059組(OVA+thrombin+pERK1/2-inh組)、凝血酶+PAR-1抑制劑ER-112780-06組(OVA+thrombin+PAR-1-inh組),每組6只。以卵蛋白(OVA)致敏并吸入激發(fā)制備大鼠哮喘模型。模型組于第1、8天注射卵蛋(lml/kg),第15天始霧化2%卵蛋白(現(xiàn)配)每次30分鐘,每周3次,共6周,SAL組以生理鹽水代替。第15天起霧化前,OVA+thrombin組進行凝血酶霧化吸入72u/只,OVA+hirudin組進行hirudin氣溶膠2000AUT吸入,OVA+thrombin+pERKl/2-inh組霧化凝血酶霧化吸入72u／只后每只腹腔注射PD98059(3mg/kg), OVA+thrombin+PAR-1-inh組進行凝血酶霧化吸入72u／只及濃度為20uM的ER-112780-06霧化吸入30分鐘,其他各組以生理鹽水代替。造模結(jié)束后,取大鼠肺組織,用免疫組化、western blot及PCR檢測PAR-1的表達,用western blot檢測pERK1/2的表達。結(jié)果1.一般表現(xiàn)實驗前各組大鼠行為能力正常,在造模過程中,模型組均出現(xiàn)不同程度的異常表現(xiàn)。SAL組：在激發(fā)時無煩躁不安,呼吸平穩(wěn),行動靈敏,生活習性正常,毛色有光澤。OVA+SAL組：在激發(fā)時均出現(xiàn)不同程度的煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁等癥狀,嚴重者呼吸減慢或節(jié)律不齊,行動遲緩或俯伏不動。經(jīng)過多次激發(fā)后,OVA+SAL組上述癥狀反而有所減輕,毛色無光澤。OVA+thrombin組：在激發(fā)時煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁等癥狀非常明顯,比OVA+SAL組嚴重；后期則多俯伏不動,毛色暗黃色,有一只死亡。OVA+hirudin組：在激發(fā)時有輕度煩躁不安、呼吸略增快,無呼吸減慢或節(jié)律不齊,與OVA+thrombin組相比較癥狀明顯減輕。OVA+thrombin+pERK1/2-inh組：在激發(fā)時出現(xiàn)煩躁不安現(xiàn)象較輕,呼吸增快,偶爾出現(xiàn)大小便失禁狀況,無呼吸減慢或節(jié)律不齊,無行動遲緩或俯伏不動現(xiàn)象,毛色正常。OVA+thrombin+PAR-1-inh組：在激發(fā)時輕度煩躁不安、呼吸增快,無呼吸減慢或節(jié)律不齊,無行動遲緩或俯伏不動現(xiàn)象,毛色正常。2.氣道重塑OVA+SAL組與SAL組比較,平滑肌增厚。OVA+thrombin組與OVA+SAL組比較,平滑肌增厚更明顯。OVA+hirudin組與OVA+thrombin組相比較,平滑肌無明顯增厚。OVA+thrombin+pERK1/2-inh組、OVA+thrombin+PAR-1-inh組分別與OVA+thrombin組相比平滑肌增厚不明顯。3. Western blot檢測各組肺組織pERK1/2表達結(jié)果SAL組：正常對照組大鼠肺組織僅有極少量pERK1/2的表達。OVA+SAL組：pERK1/2表達水平很高,即ERK1/2的磷酸化水平很高,與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05)。OVA+thrombin組：ERK1/2的磷酸化水平極高,與哮喘組比較有統(tǒng)計學意義(圖3,P0.05)。OVA+thrombin+pERK1/2-inh組：pERKl/2表達水平低,與T組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.PAR-1蛋白表達PAR-1陽性細胞SAL組表達水平很低,OVA+SAL組表達水平很高,與SAL組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05), OVA+thrombin組表達水平最高,與OVA+SAL組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05), OVA+hirudin組的表達則下降,與OVA+thrombin組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05), OVA+thrombin+PAR-1-inh組的表達水平明顯降低,與OVA+thrombin組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論1.凝血酶可以上調(diào)大鼠呼吸道PAR-1的基因與蛋白表達；2.凝血酶可通過PAR-1激活ERK1/2信號通路；3.凝血酶激活pERKl/2信號通路,從而參與哮喘大鼠氣道重塑。第二部分 哮喘大鼠凝血酶、氣道炎癥、氣道重塑的相關性研究研究目的氣道炎癥是急、慢性肺的發(fā)病機理,哮喘即包括在內(nèi)。傷害性的刺激物可以激活各種細胞,包括嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞,釋放血管活性物質(zhì)、有毒代謝物和細胞因子,從而參與急性和慢性支氣管收縮。IL-6即是參與其中的一個細胞因子,亦是一種炎癥存在的生化指標。研究證實,凝血酶通過介導NF-κB的激活參與了氣道雁陣反應。claudin-1作為一種縫隙連接蛋白,多表達于上皮細胞膜,保護肺組織免受病原體的侵害。研究表明,哮喘患者肺組織中緊密連接帶變薄或被破壞。而反復的炎癥刺激可引起組織損傷及后續(xù)的組織結(jié)構(gòu)改變即氣道重塑。本實驗外源性給予凝血酶及凝血酶抑制劑,建立標準大鼠哮喘動物模型。通過ELISA法、HE染色、免疫熒光檢測、免疫組化、western blot等試驗方法,探討凝血酶對哮喘大鼠氣道炎癥的影響,從而為凝血酶促進哮喘氣道重塑機制的探討提供新的思路。研究方法將24只雌性大鼠隨機分為4組：正常對照組(SAL組)、哮喘組(OVA+SAL組)、凝血酶組(OVA+thrombin組)、凝血酶抑制劑組(OVA+hirudin組),每組6只。參照文獻方法制備大鼠哮喘模型。第15天開始用402超聲霧化器予大鼠霧化吸入2%OVA懸液50m1(現(xiàn)配),每次30分鐘,每周3次,連續(xù)激發(fā)6周。霧化前30分鐘,OVA+thrombin組每只大鼠給予霧化吸入凝血酶72u,OVA+hirudin組每只大鼠給予霧化吸入水蛭素(500u/kg)。SAL組用生理鹽霧化。造模成功后,取大鼠肺泡灌洗液,采用ELISA法測其中的凝血酶活性。取肺組織,應用HE染色觀察炎性細胞的浸潤情況,免疫熒光檢測各組大鼠氣道claudin-1的表達情況,免疫組化法檢測IL-6表達水平,western blot法測定NF-kB蛋白表達情況。結(jié)果1.肺組織炎癥浸潤情況觀察OVA+SAL組：支氣管壁、間隔及血管周圍有大量的炎性細胞浸潤,與SAL組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)。OVA+thrombin組炎癥浸潤情況較OVA+SAL組更為明顯(P0.05)。OVA+hirudin組炎性細胞浸潤減輕較()VA+thrombin組減輕(P0.05)。2.免疫熒光檢測claudin-1的表達OVA+SAL組氣道上皮細胞胞膜claudin-1表達減少,上皮完整性稍有破壞與SAL組比較有差異。OVA+thrombin組氣道上皮細胞胞膜claudin-1表達微弱,上皮完整性破壞嚴重,與OVA+SAL組比較有差異。OVA+hirudin組claudin-1陽性表達細胞較OVA+thrombin組增多。3.免疫組織化學法肺組織中IL-6的表達結(jié)果OVA+SAL組較SAL組IL-6表達增多(P0.05)。OVA+thrombin組IL-6陽性表達較OVA+SAL組明顯(P0.05)。OVA+hirudin組較OVA+thrombin組IL-6表達減少(P0.05)。4. Western Blot法檢測肺組織中NF-kB蛋白表達的結(jié)果OVA+SAL組較SAL組肺組織中NF-kB蛋白表達增加(P0.05)。OVA+thrombin組較OVA+SAL組肺組織中NF-kB蛋白表達增高(P0.05)。OVA+hirudin組較OVA+thrombin組肺組織中NF-kB蛋白表達減少(P0.05)。結(jié)論1.凝血酶促進哮喘大鼠氣道炎癥反應；2.凝血酶可導致哮喘大鼠氣道上皮claudin-1表達減少。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R725.6

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本文編號：2449220