【摘要】：遺傳代謝病(inherited metabolic diseases,IMD)是一組由單一酶活性缺陷引起的遺傳病,該酶是蛋白質(zhì)、脂肪或碳水化合物正常代謝所必須,酶缺陷導(dǎo)致有害的代謝產(chǎn)物蓄積引起疾病。目前發(fā)現(xiàn)IMD超過500種,這些疾病經(jīng)常導(dǎo)致患者存活時間受限、多系統(tǒng)受累及進行性進展;絕大多數(shù)IMD患者在兒童時期出現(xiàn)臨床癥狀,疾病進展較慢的患者可能在成年出現(xiàn)癥狀。目前對嚴重IMD治療仍十分有限,治療原則是減少毒物蓄積、補充需要、促進排泄;治療手段如飲食療法、酶替代或底物降解、骨髓移植或肝移植等;但任何一種治療方法都存在弊端。如飲食療法可導(dǎo)致IMD患者營養(yǎng)不良;酶替代治療不能通過血-腦屏障改善有毒代謝產(chǎn)物引起的腦損傷,且治療費用昂貴;底物降解治療經(jīng)常被抗蛋白質(zhì)抗體阻斷,導(dǎo)致過敏反應(yīng)、過敏性休克等;造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)不能及時改善嚴重遺傳代謝病患者腦損傷等。嚴重的IMD患者通常伴有腦損傷,臨床表現(xiàn)主要為智力、精神下降;嚴重神經(jīng)系統(tǒng)疾病經(jīng)常導(dǎo)致患者死亡。動物研究表明移植的HSC在大腦分化為小膠質(zhì)細胞,通過血-腦屏障釋放有功能的酶,發(fā)揮治療腦損傷的作用。但是移植的HSC分化為小膠質(zhì)細胞所需時間較長,小鼠大約需要6月,人腦大約需要6-12月;因此HSCT不能及時改善腦損傷。利用神經(jīng)干細胞(neural stem cell,NSC)具有自我更新能力和分化功能,已成功用于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷及神經(jīng)退行性疾病模型,如急性腦缺血損傷、新生鼠缺氧缺血腦損傷、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥、帕金森病等。神經(jīng)干細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型有一定的療效,但細胞移植后宿主介導(dǎo)的排斥反應(yīng)及存活率低,限制了其治療作用的最大發(fā)揮。理論上講,人類來源的供者細胞是最有價值的,因為只有人類來源的細胞將來可能被批準應(yīng)用于臨床試驗治療IMD。為了提高人來源細胞異種移植存活,通過新生期大、小鼠人類細胞脫敏,誘導(dǎo)成年期細胞移植耐受的研究已有報道。2009年Claire M Kelly等報道新生SD大鼠生后0-5d腹腔注射105人來源NSC(human neural stem cell,h NSC),10-12周后大腦皮層或紋狀體移植(2.5-5)×105 h NSC,移植后12-40周植入率增高,移植的細胞能長期存活。2012年研究報道新生期BALB/c小鼠和Wistar大鼠腹腔注射105 h NSC,6周后大腦移植3×105 h NSC,移植后2-3周h NSC不能檢測到。2014年Virginia B.Mattis等報道新生小鼠生后2-3d腹腔注射105h NSC,8周后大腦移植2×105 h NSC,移植后4周h NSC不能檢測到。2013年研究報道以成年Wistar大鼠腦梗模型為基礎(chǔ)進行h NSC脫敏或免疫抑制劑治療,h NSCT后2周移植的h NSC幾乎不能檢測到;提示在局部腦損傷Wistar大鼠,不同途徑免疫抑制不能延長移植的人臍血來源NSC存活。2016年Andreas heuer等研究報道新生期SD大鼠生后2d和4d進行腹腔注射分化前的人來源胚胎干細胞進行脫敏,成年后(最小15周齡)建立多巴胺能纖維束損傷模型,建模后4-5周進行人胚胎干細胞來源的神經(jīng)前體細胞大腦移植,移植后18-22周89%大鼠可檢測到人類細胞,提示新生期人來源細胞脫敏可以實現(xiàn)成年后人來源細胞移植長期存活。以上研究提示新生鼠除SD大鼠外,其它如BALB/c、C57BL/6、NOD SCID、B6C3F1/J、FVB(P1-4)小鼠及Wistar大鼠,新生期腹腔注射人來源細胞進行脫敏,成年后大腦移植均不能耐受。SD大鼠細胞脫敏可以實現(xiàn)免疫耐受,可能與該物種是遠交系相關(guān);也可能新生期SD大鼠較同期其它類型鼠免疫更不健全。建立清髓異基因造血干細胞(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)模型摧毀免疫系統(tǒng),模擬新生期鼠免疫不健全;探討allo-HSCT免疫不健全時期進行第三方人來源細胞脫敏,免疫健全后進行細胞移植能否實現(xiàn)耐受。文獻報道HSCT模型多選用小鼠進行研究,受體BALB/c小鼠和供體C57BL/6小鼠可以成功建立allo-HSCT模型,可以模擬臨床allo-HSCT免疫不健全時期。因此本研究選用BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠建立allo-HSCT模型。本研究可為IMD患者allo-HSCT不能及時改善腦損傷提供可參考的途徑,國內(nèi)外尚無報道。目的基于新生期h NSC脫敏研究,致死性全身放射摧毀小鼠免疫及造血功能,通過小鼠allo-HSCT解救,在免疫重建過程中應(yīng)用h NSC多次脫敏,實現(xiàn)免疫重建后對h NSC的免疫耐受。方法9-12周雌性BALB/c小鼠為受體鼠,9-12周雌性C57BL/6小鼠為供者鼠。分離供者鼠骨髓細胞,去T細胞進行尾靜脈骨髓移植,建立穩(wěn)定嵌合清髓小鼠allo-HSCT模型。模型建立成功后,90只模型小鼠隨機分為三組:A組(NSCT組)、B組(脫敏組)、C組(環(huán)孢素組)。B組在HSCT后第1、3、7d進行h NSC腹腔注射脫敏,A、C組在相同時間點進行腹腔注射50ul生理鹽水。HSCT穩(wěn)定嵌合及供者T細胞植入后行小鼠大腦h NSCT,C組移植前1d至脫臼處死當(dāng)日,每日行腹腔注射10mg/kg環(huán)孢素,A、B組每日行腹腔注射10mg/kg環(huán)孢素相同體積的生理鹽水。HNSCT后2、8、12W,三組均行h NSC體外殺傷試驗、體內(nèi)存活率及分化、排斥反應(yīng)、炎性反應(yīng)檢測。結(jié)果1.受體BALB/C小鼠經(jīng)致死性放射清髓后,供體C57BL/6小鼠骨髓去T細胞HSCT;HSCT后2周,受體鼠存活率為100%,小鼠精神可,活動有力;HSCT后4周,受體鼠存活率約80%,無脫毛癥狀。2.清髓小鼠allo-HSCT后4、8周,供體鼠細胞嵌合率均為76%±1%,供體鼠T細胞占植入細胞的37%±1%。3.人來源NSCT后12周,進行受體BALB/C小鼠脾臟T細胞體外殺傷h NSC實驗檢測。A、B、C組體外殺傷率分別為28.26%±2.80%、23.94%+2.11%、23.62%±0.15%,P=0.36。三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。4.人來源NSCT后2、8、12周,A、B、C組移植的h NSC存活率進行比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。NSCT后2周,A、B、C組移植的h NSC存活率分別為0.42%±0.02%、0.45%±0.05%、0.53%±0.01%,P=0.08;HNSCT后8周,A、B、C組移植的h NSC存活率分別為0.21%±0.01%、0.18%±0.02%、0.24%±0.02%,P=0.20;HNSCT后12周,A、B、C組移植的h NSC存活率分別為0.16%±0.01%、0.16%±0.01%、0.20%±0.01%,P=0.26。5.人來源NSCT后2、8、12周,小鼠大腦冰凍切片免疫熒光染色提示:h NSCT后2、8、12周,三組排斥反應(yīng)及炎性反應(yīng)指標MHC-Ⅱ、CD3、Iba-1、CD68均為陽性。移植的h NSC分化情況:移植后2周,三組GFAP(星形膠質(zhì)細胞)、β-tubulin(神經(jīng)元)免疫熒光染色均為陰性;移植后8、12周,GFAP免疫熒光染色三組均為陽性,β-tubulin免疫熒光染色三組均為陰性。結(jié)論1.骨髓去T細胞移植可以成功建立清髓異基因小鼠HSCT模型。2.清髓小鼠allo-HSCT免疫重建中,盡管h NSC脫敏療法不能實現(xiàn)h NSC免疫耐受,但是可以少數(shù)長期存活。3.少數(shù)存活的h NSC可以長期存活,并且短期可能分化為能分泌多種酶的星形膠質(zhì)細胞,相對供者HSC于大腦分化為能分泌正常酶的白細胞及時,為臨床治療IMD腦損傷提供了可參考的途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R725.9

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郭宏鋒,喬振華,蘇麗萍,馬梁明,朱鐳,葛曉燕,李蓉萍;非清髓異基因造血干細胞移植后免疫重建的初步研究[J];中華血液學(xué)雜志;2003年08期

2 陳智,吳南屏;高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療時代的免疫重建問題[J];浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2003年02期

3 葉國芬;;異基因造血干細胞移植免疫重建的檢測和護理[J];現(xiàn)代護理;2006年24期

4 李寧;危劍安;宋春鑫;;高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療免疫重建的研究進展[J];山西醫(yī)藥雜志(下半月刊);2008年12期

5 高飛;;免疫重建炎癥綜合征[J];中華實驗和臨床感染病雜志(電子版);2010年02期

6 劉震;王階;林洪生;李勇;;中藥免疫2號方對艾滋病患者免疫重建的研究[J];中國中藥雜志;2013年15期

7 言穆琳;余，

本文編號：2435380