【摘要】：背景： 新發(fā)傳染病始終威脅著人類的健康。發(fā)現(xiàn)和鑒定新病毒以及確定新病毒與疾病的關系是預防、診斷和治療新發(fā)病毒性傳染病的首要任務。高通量測序技術突破了傳統(tǒng)技術方法的局限,可以直接以標本中所有的遺傳物質為研究對象,從而能夠快速地鑒定出標本中存在的病毒,形成了一門研究特定環(huán)境中病毒群落的新興學科：病毒宏基因組學。傳統(tǒng)意義上有很多用于發(fā)現(xiàn)新病毒的方法,但利用高通量測序發(fā)現(xiàn)新病毒具有信息量大、對標本所含信息無偏倚等獨特優(yōu)點,使得該技術已成為目前病毒發(fā)現(xiàn)最為重要的前沿技術之一。在短短的幾年里,人們依靠這種技術發(fā)現(xiàn)了很多有意義的病毒,研究領域涉及到人類、動物、環(huán)境、水體等,充分顯示出其在病毒診斷、溯源、預警等方面的實用意義。 腹瀉是各個年齡段的人類和動物中常見的疾病,可由細菌、病毒和寄生蟲等病原引起,而輪狀病毒、杯狀病毒、腸道腺病毒和星狀病毒是引起人類腹瀉最主要的病毒性病原。在世界范圍內,每年有200多萬5歲以下腹瀉兒童死亡,并且發(fā)展中國家占有較大的比例�，F(xiàn)有的檢測技術只能發(fā)現(xiàn)60%的腹瀉病例的病原,仍有近40%的病例查不出具體病原。其中部分腹瀉的未知病因可能是目前暫未被發(fā)現(xiàn)的病毒。腹瀉在兒童中的發(fā)生率遠高于成人,嚴重影響了兒童的健康,分析腹瀉兒童與健康對照兒童糞便標本中的病毒群落差異以及發(fā)掘潛在的新病毒將為診斷不明腹瀉的病因提供新的途徑。此外,豬作為與人類接觸最為密切的經(jīng)濟動物之一是人獸共患病的重要宿主,被認為是天然的病原體庫。因此,開展其糞便中病毒譜的研究對預警潛在的人類新發(fā)病毒病也具有重要意義。 方法： 1、以豬的糞便標本為研究對象,摸索并建立適用于454高通量測序的糞便標本處理方法；通過對海量序列進行生物信息分析,研究豬糞便中的病毒譜,發(fā)現(xiàn)潛在的新病毒；進一步利用生物信息學、分子生物學與免疫學等方法,了解新病毒的基因結構、分子流行病學及血清流行學等特點,初步探索新病毒在人類中存在感染的潛在可能。 2、應用454高通量測序分析了腹瀉與健康兒童糞便標本中的病毒性病原組成情況；采用統(tǒng)計學方法分析了主要病毒性病原的種類與序列數(shù)量在兩類標本中的差異；通過序列同源性比對分析,發(fā)現(xiàn)潛在的新病毒序列,并了解其在兩類不同標本中的檢出情況。 結果： 從9份健康豬的糞便標本中共獲得40萬余條序列,平均長度達361bp,其中病毒序列為5437條,涉及病毒種類達20余種；基因序列與進化樹分析表明標本中存在多株不同的新型星狀病毒、博卡病毒和類雙埃可病毒,且這些病毒在健康豬糞便標本中廣泛存在,檢出率分別為：51.5%、72%和13.5%。對新型的類雙�？刹《綪LV-CHN進行深入分析顯示,該株病毒基因組全長為6832bp,編碼一個長為2132個氨基酸的完整多聚蛋白,與已知雙�？刹《緦俚腖jungan病毒有最大同源性(氨基酸同源性為32%)。值得注意的是,在本研究整理相關結果時,法國報道了一株與PLV-CHN極為類似的病毒SPaV1,核苷酸與氨基酸同源性分別達到82%和89%,基因特點與進化分析均顯示PLV-CHN與SPaV1最為相近,二者形成了小RNA病毒科的一個新的屬——Pasivirus。對該病毒3D區(qū)進行的分子流行病學顯示,健康豬糞便標本的檢出率為20%；腹瀉與正常兒童糞便以及腦炎兒童腦脊液中均未檢出該病毒。但ELISA結果表明健康人群的血清中該病毒或與該病毒相關的抗體陽性率高達63.5%,其中12歲之前的絕大部分兒童顯示血清陽性。 腹瀉與對照兒童糞便標本中獲得的序列數(shù)量分別為385288條與290647條,兩類標本中的病原組成種類無明顯差別,除去未分類序列,細菌、噬菌體與病毒序列的數(shù)量在兩類標本中均占據(jù)前三位。而對病毒宏基因組分析顯示,病毒的序列在兩類標本中的數(shù)量差別較大,分別為7744條和1949條；主要病毒序列組成也不盡相同：腹瀉組標本中前三位的病毒依次為Anellovirus、杯狀病毒和Salivirus,正常組標本中前三位的病毒依次為Anellovirus、 Tymovirus和HPeV;其中Anellovirus在兩類標本中的陽性率和序列數(shù)量的差異均無統(tǒng)計學意義,而諾如病毒、札如病毒和Salivirus的陽性率和序列數(shù)量在兩類標本中均具有統(tǒng)計學差異,顯示了與兒童腹瀉的相關性；而其中的GIV型諾如病毒是首次在中國腹瀉兒童糞便標本中發(fā)現(xiàn)。此外,在腹瀉兒童標本中,出現(xiàn)大量與已知病毒同源性很低的序列,其中5個序列讀長為具有潛在意義新病毒的序列,分別與Densovirus、鼠細小病毒、未分類densovirus、蛙腺病毒和乳頭瘤病毒最匹配,且氨基酸同源性均50%。 結論： 1、豬糞便中存在多種新病毒序列,表明豬是病毒多樣型的生物庫,在人類病毒病的預警研究中要給與重視。 2.我國健康豬中發(fā)現(xiàn)了全新的類雙�？刹《綪LV-CHN,它與法國同期發(fā)現(xiàn)的SPaV1形成了小RNA病毒科的一個新的屬——Pasivirus。 3、人類兒童早期可能存在全新的小RNA病毒科新屬(Pasivirus)成員(如PLV-CHN)的感染。 4、腹瀉與對照兒童糞便標本中的病原組成、種類與數(shù)量存在差異,其中部分病毒的潛在意義還需要深入探討。 5、兒童腹瀉標本中發(fā)現(xiàn)了五個新病毒序列,其生物學意義及與腹瀉的相關性有有待深入研究。 6、中國腹瀉兒童中第一次報道諾如病毒GIV型的存在。
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【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R725.7;S852.65

【參考文獻】

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1 方肇寅;謝華萍;呂紅霞;劉娜;章青;段招軍;Duncan Steele;Baoming Jiang;Xi Jiang;;1999~2005年我國嬰幼兒人杯狀病毒腹瀉研究[J];病毒學報;2007年01期

2 徐建國;;發(fā)現(xiàn)新病原、建立新病原學的技術與理論體系[J];微生物與感染;2010年03期

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本文編號：2404051