【摘要】：目的:小兒手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)是一種死亡率高、伴有兒童相關的無菌性腦膜炎和嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的季節(jié)性流行性感染性疾病,主要是腸道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)感染。因此,本實驗從病毒受體與細胞自噬角度,利用細胞形態(tài)學、蛋白相互作用等研究方法,探究了P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)在腸道病毒71型感染正常胃上皮細胞(normal gastric epithelial cell line-1,GES-1)誘導自噬調(diào)變中的作用,旨在為明確EV71致病機制提供重要的理論基礎和實驗依據(jù),為手足口病的早期預防和臨床治療提供新的思路。方法:1.細胞培養(yǎng)與病毒感染分別培養(yǎng)人胃上皮細胞和橫紋肌肉瘤細胞(rhabdomyosarcoma,RD-A),將細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%青霉素/鏈霉素(200 U/ml)的L-谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)基內(nèi),并置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱。待細胞增長至90%,經(jīng)不含EDTA的胰蛋白酶消化進行傳代培養(yǎng)。EV71(fuyang-0805)以一定的感染復數(shù)(indicated multiplicity of infection,MOI)感染GES-1。病毒感染3 h后清洗細胞,然后用含2%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進行細胞培養(yǎng),到感染的時間點后收取培養(yǎng)細胞和上清液。收集感染細胞內(nèi)的病毒顆粒前,要3次反復凍融細胞。病毒原液存放在-80℃冰箱,感染之前4℃復蘇,病毒滴度可通過50%組織培養(yǎng)感染劑量(50%tissue culture infectious doses,TCID50)表示,根據(jù)Reed Muench法使用96孔板接種RD-A細胞進行不同病毒濃度梯度的感染來測定TCID50。2.細胞處理GES-1細胞以EV71滴度為MOI=10分別感染6、12、24小時。封閉時,在感染前用含PSGL-1抗體(2 mg/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)GES-1,阻止EV71與細胞受體PSGL-1的結(jié)合。通過熒光顯微鏡檢測自噬標記蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1light chain 3,LC3)時,將培養(yǎng)的GES-1轉(zhuǎn)染RFP-LC3/GFP-LC3質(zhì)粒24小時后進行病毒感染,最后觀察并在同一倍鏡計數(shù)5個不同視野下細胞中熒光聚集點的數(shù)目和DAPI染色的細胞核數(shù),并計算LC3熒光斑點數(shù)/細胞數(shù)的百分率。3.實時熒光定量PCR用TRIzol Reagent分別從不同GES-1細胞處理組提取細胞的總RNA,并通過快速c DNA第一鏈c DNA合成試劑盒將RNA(2μg)轉(zhuǎn)換為c DNA。采用the Bestar?Sybr Green q PCR Mastermix通過實時熒光定量PCR技術檢測PSGL-1的RNA水平變化,設置熱循環(huán)條件:95℃初始變性2分鐘;95℃變性10秒,退火溫度63℃30秒,最后延伸72℃30秒,共40次循環(huán)。4.免疫熒光顯微鏡在4℃用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)固定細胞20分鐘后清洗;用含1%Triton X-100的PBS在室溫細胞穿孔15分鐘;用含5%牛血清白蛋白PBS液在室溫封閉60分鐘;用LC3與PSGL-1單克隆抗體在4℃孵育,過夜。次日,清洗后加入熒光標記的二抗,并加入DAPI核染色;然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。5.免疫印跡和免疫共沉淀收集細胞并裂解;測定蛋白質(zhì)濃度;樣品通過SDS-PAGE電泳分離,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜;膜用5%脫脂奶粉常溫封閉2小時,然后分別孵育P62抗體,LC3抗體,VP1抗體,PSGL-1和β-actin抗體4℃過夜;清洗后,用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗在室溫下孵育1小時。最后使用化學發(fā)光顯影劑顯影。免疫共沉淀:在4℃過夜孵育細胞裂解液與單克隆抗體(1 mg)后加入Protein G Agarose珠子,進行2小時的搖動孵育;洗滌珠子后溶解,取免疫共沉淀緩沖液通過12%的SDS-PAGE進行電泳分離(方法同免疫印跡)。6.統(tǒng)計分析采用t檢驗進行統(tǒng)計學比較,P0.05判斷有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1.EV71感染誘導GES-1細胞發(fā)生自噬:免疫印跡結(jié)果顯示隨著病毒感染時間的增加,LC3II逐漸增加,LC3-I向LC3II轉(zhuǎn)換明顯;且在12 h后呈明顯增加(P0.05),同時免疫熒光結(jié)果顯示病毒感染12 h后LC3點狀聚集明顯增加(P0.01)。2.PSGL-1抗體封閉受體可阻止EV71感染GES-1:GES-1細胞在PSGL-1抗體預先封閉后再染毒,與未封閉組相比胞內(nèi)病毒蛋白結(jié)構蛋白VP-1明顯減少(P0.001),同時檢測胞內(nèi)病毒滴度也顯著降低(P0.01)。3.EV71感染GES-1促進PSGL-1高表達和點狀聚集:通過免疫印跡檢測顯示感染組PSGL-1明顯增多(P0.05),同時實時熒光定量PCR測得感染組PSGL-1的m RNA水平明顯升高(P0.05);免疫熒光結(jié)果顯示感染組PSGL-1出現(xiàn)明顯點狀聚集(P0.01)。4.PSGL-1參與EV71感染GES-1誘導的細胞自噬:采用免疫熒光技術觀察發(fā)現(xiàn)PSGL-1可與LC3在細胞內(nèi)發(fā)生共定位,通過免疫共沉淀技術檢測PSGL-1和P62有蛋白相互作用。結(jié)論:EV71感染GES-1誘導細胞自噬,而這一現(xiàn)象可能是EV71通過受體PSGL-1與P62之間的蛋白相互作用實現(xiàn)的。這些結(jié)果可能為幫助我們理解EV71誘導自噬的機制提供理論基礎,為預防和治療EV71感染提供一種新的策略和思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R725.1

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本文編號：2385250