【摘要】：目的:小兒手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)是一種死亡率高、伴有兒童相關(guān)的無(wú)菌性腦膜炎和嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的季節(jié)性流行性感染性疾病,主要是腸道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)感染。因此,本實(shí)驗(yàn)從病毒受體與細(xì)胞自噬角度,利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、蛋白相互作用等研究方法,探究了P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)在腸道病毒71型感染正常胃上皮細(xì)胞(normal gastric epithelial cell line-1,GES-1)誘導(dǎo)自噬調(diào)變中的作用,旨在為明確EV71致病機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),為手足口病的早期預(yù)防和臨床治療提供新的思路。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染分別培養(yǎng)人胃上皮細(xì)胞和橫紋肌肉瘤細(xì)胞(rhabdomyosarcoma,RD-A),將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%青霉素/鏈霉素(200 U/ml)的L-谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)基內(nèi),并置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱。待細(xì)胞增長(zhǎng)至90%,經(jīng)不含EDTA的胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。EV71(fuyang-0805)以一定的感染復(fù)數(shù)(indicated multiplicity of infection,MOI)感染GES-1。病毒感染3 h后清洗細(xì)胞,然后用含2%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),到感染的時(shí)間點(diǎn)后收取培養(yǎng)細(xì)胞和上清液。收集感染細(xì)胞內(nèi)的病毒顆粒前,要3次反復(fù)凍融細(xì)胞。病毒原液存放在-80℃冰箱,感染之前4℃復(fù)蘇,病毒滴度可通過(guò)50%組織培養(yǎng)感染劑量(50%tissue culture infectious doses,TCID50)表示,根據(jù)Reed Muench法使用96孔板接種RD-A細(xì)胞進(jìn)行不同病毒濃度梯度的感染來(lái)測(cè)定TCID50。2.細(xì)胞處理GES-1細(xì)胞以EV71滴度為MOI=10分別感染6、12、24小時(shí)。封閉時(shí),在感染前用含PSGL-1抗體(2 mg/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)GES-1,阻止EV71與細(xì)胞受體PSGL-1的結(jié)合。通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)自噬標(biāo)記蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1light chain 3,LC3)時(shí),將培養(yǎng)的GES-1轉(zhuǎn)染RFP-LC3/GFP-LC3質(zhì)粒24小時(shí)后進(jìn)行病毒感染,最后觀察并在同一倍鏡計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野下細(xì)胞中熒光聚集點(diǎn)的數(shù)目和DAPI染色的細(xì)胞核數(shù),并計(jì)算LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)/細(xì)胞數(shù)的百分率。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR用TRIzol Reagent分別從不同GES-1細(xì)胞處理組提取細(xì)胞的總RNA,并通過(guò)快速c DNA第一鏈c DNA合成試劑盒將RNA(2μg)轉(zhuǎn)換為c DNA。采用the Bestar?Sybr Green q PCR Mastermix通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PSGL-1的RNA水平變化,設(shè)置熱循環(huán)條件:95℃初始變性2分鐘;95℃變性10秒,退火溫度63℃30秒,最后延伸72℃30秒,共40次循環(huán)。4.免疫熒光顯微鏡在4℃用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)固定細(xì)胞20分鐘后清洗;用含1%Triton X-100的PBS在室溫細(xì)胞穿孔15分鐘;用含5%牛血清白蛋白PBS液在室溫封閉60分鐘;用LC3與PSGL-1單克隆抗體在4℃孵育,過(guò)夜。次日,清洗后加入熒光標(biāo)記的二抗,并加入DAPI核染色;然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。5.免疫印跡和免疫共沉淀收集細(xì)胞并裂解;測(cè)定蛋白質(zhì)濃度;樣品通過(guò)SDS-PAGE電泳分離,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜;膜用5%脫脂奶粉常溫封閉2小時(shí),然后分別孵育P62抗體,LC3抗體,VP1抗體,PSGL-1和β-actin抗體4℃過(guò)夜;清洗后,用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1小時(shí)。最后使用化學(xué)發(fā)光顯影劑顯影。免疫共沉淀:在4℃過(guò)夜孵育細(xì)胞裂解液與單克隆抗體(1 mg)后加入Protein G Agarose珠子,進(jìn)行2小時(shí)的搖動(dòng)孵育;洗滌珠子后溶解,取免疫共沉淀緩沖液通過(guò)12%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離(方法同免疫印跡)。6.統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,P0.05判斷有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.EV71感染誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞發(fā)生自噬:免疫印跡結(jié)果顯示隨著病毒感染時(shí)間的增加,LC3II逐漸增加,LC3-I向LC3II轉(zhuǎn)換明顯;且在12 h后呈明顯增加(P0.05),同時(shí)免疫熒光結(jié)果顯示病毒感染12 h后LC3點(diǎn)狀聚集明顯增加(P0.01)。2.PSGL-1抗體封閉受體可阻止EV71感染GES-1:GES-1細(xì)胞在PSGL-1抗體預(yù)先封閉后再染毒,與未封閉組相比胞內(nèi)病毒蛋白結(jié)構(gòu)蛋白VP-1明顯減少(P0.001),同時(shí)檢測(cè)胞內(nèi)病毒滴度也顯著降低(P0.01)。3.EV71感染GES-1促進(jìn)PSGL-1高表達(dá)和點(diǎn)狀聚集:通過(guò)免疫印跡檢測(cè)顯示感染組PSGL-1明顯增多(P0.05),同時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)得感染組PSGL-1的m RNA水平明顯升高(P0.05);免疫熒光結(jié)果顯示感染組PSGL-1出現(xiàn)明顯點(diǎn)狀聚集(P0.01)。4.PSGL-1參與EV71感染GES-1誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬:采用免疫熒光技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)PSGL-1可與LC3在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生共定位,通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)PSGL-1和P62有蛋白相互作用。結(jié)論:EV71感染GES-1誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,而這一現(xiàn)象可能是EV71通過(guò)受體PSGL-1與P62之間的蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果可能為幫助我們理解EV71誘導(dǎo)自噬的機(jī)制提供理論基礎(chǔ),為預(yù)防和治療EV71感染提供一種新的策略和思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R725.1

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本文編號(hào)：2385250