【摘要】：背景：新生兒窒息，或稱為缺氧缺血性腦�。╤ypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是指圍生期由窒息引起的急性、亞急性腦損傷。該病具有較高的發(fā)病率。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，每年由新生兒窒息所導(dǎo)致新生兒死亡大約有920,000例，此外還有110萬(wàn)例與該病相關(guān)的流產(chǎn)病例。同時(shí)，在存活的缺氧缺血性腦病的患兒中均存在不同程度的后遺癥，并長(zhǎng)期影響患兒的身心健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在存活的新生兒窒息患兒中，大約有超過(guò)100萬(wàn)的兒童患有神經(jīng)系統(tǒng)方面的功能障礙，如：腦癱，癲癇，智力發(fā)育遲緩和學(xué)習(xí)障礙。 在圍產(chǎn)期長(zhǎng)時(shí)間氧氣的缺乏是導(dǎo)致新生兒缺氧缺血性腦損傷的直接原因。在缺氧缺血（hypoxic-ischemic, HI）誘導(dǎo)下，一個(gè)復(fù)雜的連鎖反應(yīng)被激活，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害。在這個(gè)過(guò)程中，補(bǔ)體系統(tǒng)起到非常關(guān)鍵的負(fù)向作用。在缺氧缺血的條件下，補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)各種細(xì)胞因子的合成和釋放。最終引起不同程度的缺氧缺血性腦損傷。高劑量人免疫球蛋白G （Humanimmunoglobulin G, H-IgG）可以通過(guò)清除有害的補(bǔ)體片段，阻斷補(bǔ)體途徑，抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕缺氧缺血性腦損傷。在小鼠的短暫性大腦中動(dòng)脈堵塞模型中，給予高劑量的H-IgG能夠顯著減少腦梗死區(qū)的大小以及隨后的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。并且證實(shí)活性補(bǔ)體C3b片段在腦損傷區(qū)域大量沉積。 目的：在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用生后7天的新生大鼠做為研究對(duì)象，通過(guò)建立缺氧缺血性腦損傷模型來(lái)模擬新生兒缺氧缺血性腦損傷。本實(shí)驗(yàn)的目的在于評(píng)估H-IgG對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的腦保護(hù)作用，并對(duì)其潛在機(jī)制進(jìn)行初步探討。為臨床治療新生兒缺氧缺血性腦損傷提供新的治療方案及理論基礎(chǔ)。 方法：本實(shí)驗(yàn)首先建立P7Wistar大鼠幼崽的局灶性缺氧缺血性腦損傷（Hypoxicischemic brain injury）。選擇出生后7天的Wistar大鼠幼崽，于麻醉狀態(tài)下雙重結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，并與兩條結(jié)扎線之間將頸總動(dòng)脈剪斷�；謴�(fù)1小時(shí)后，將其放入持續(xù)通有8%氧氣的密閉缺氧罐內(nèi)1小時(shí)或2小時(shí)。然后取出放回母鼠處。整個(gè)模型建立過(guò)程，監(jiān)測(cè)體溫，使其保持在37.0±0.5℃。實(shí)驗(yàn)分組：（1）假手術(shù)組，1小時(shí)缺氧缺血組，2小時(shí)缺氧缺血組；（2）假手術(shù)組，單純?nèi)毖跞毖M，溶劑組，或vehicle組，高劑量H-IgG組（2.0g/kg）；（3）假手術(shù)組，造模前預(yù)處理vehicle組，預(yù)處理H-IgG組，缺氧缺血后1小時(shí)給予vehicle組，缺氧缺血后1小時(shí)給予高劑量H-IgG組；（4）假手術(shù)組，vehicle組，高劑量H-IgG組（2.0g/kg），中等劑量H-IgG組（1.0g/kg），低劑量H-IgG組（0.5g/kg）。對(duì)不同恢復(fù)時(shí)間腦組織的組織學(xué)研究采用HE染色。對(duì)于H-IgG對(duì)缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用的評(píng)估通過(guò)TTC染色評(píng)估腦損傷程度。行為學(xué)研究：對(duì)于腦損傷急性期，亞急性期及長(zhǎng)期的大腦功能評(píng)估通過(guò)nerological scale及以下幾個(gè)測(cè)試實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估：（1）righting reflect實(shí)驗(yàn)；（2）wirehanging test；（3）foot fault test。通過(guò)western blot，檢測(cè)幼鼠經(jīng)歷缺氧缺血性腦損傷之后血清及腦組織內(nèi)補(bǔ)體C3水平的變化情況，以及評(píng)估給予IgG之后幼鼠血清及腦組織內(nèi)補(bǔ)體C3的水平，并與對(duì)照組及假手術(shù)組進(jìn)行比較。通過(guò)immunochemistry，直觀地觀察補(bǔ)體C3在新生大鼠幼崽缺氧缺血性腦損傷后在腦組織中分布的部位，以及在給予H-IgG治療后腦組織內(nèi)補(bǔ)體C3的清除情況，并與對(duì)照組進(jìn)行比較分析。 結(jié)果：生后7天的新生大鼠幼崽在永久性結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈后給予1小時(shí)或2小時(shí)缺氧。通過(guò)TTC染色進(jìn)行腦損傷程度的評(píng)估。結(jié)果顯示2小時(shí)缺氧組可以建立比較穩(wěn)定的新生大鼠幼崽缺氧缺血腦損傷模型，而1小時(shí)缺氧組變異度較大。兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（X2=20.417,p=0.000,圖4.1B）。對(duì)缺氧缺血性腦損傷后的新生大鼠幼崽給予高劑量H-IgG治療，結(jié)果顯示給藥組與對(duì)照組相比，可以顯著減少腦梗死的體積及腦水腫。（P0.01,Student T test）（如圖4.3.1所示）。我們比較了不同時(shí)間點(diǎn)給予H-IgG治療。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，損傷前、后1小時(shí)給予H-IgG治療均能顯著減少腦梗死的體積及減輕腦水腫（p0.01,Student T Test）。兩個(gè)給藥組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05, Student T Test）（如圖4.3.2所示）。此外，我們對(duì)不同給藥劑量對(duì)出生后7天新生大鼠幼崽缺氧缺血性腦損傷的作用進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高劑量H-IgG（2.0g/kg）和中等劑量的H-IgG（1.0g/kg）對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷均有腦保護(hù)作用（分別為p0.01和p0.05, Student T Test）。而低劑量H-IgG（0.5g/kg）與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05, Student T Test）。通過(guò)行為學(xué)研究，與假手術(shù)組相比，，新生大鼠對(duì)側(cè)肢體感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能明顯受限，給予高劑量H-IgG(2.0g/kg)，新生大鼠對(duì)側(cè)肢體感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能明顯改善。 通過(guò)western blot檢測(cè)新生大鼠幼崽腦組織中補(bǔ)體C3在缺氧缺血性腦損傷后及給予H-IgG治療后的變化情況。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，新生大鼠缺氧缺血性腦損傷24h后腦組織中補(bǔ)體C3明顯增多，而給予H-IgG治療組可以顯著抑制這一情況的發(fā)生。高劑量H-IgG組（2.0g/kg）與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05, Student TTest）。通過(guò)Immunochemistry觀察在缺氧缺血性腦損傷后補(bǔ)體C3在腦組織中靶向的具體位置。應(yīng)用綠色熒光標(biāo)記二抗，結(jié)果顯示，與對(duì)側(cè)大腦半球及假手術(shù)組同側(cè)大腦半球相同區(qū)域相比，補(bǔ)體C3定向沉積于受損傷的神經(jīng)細(xì)胞。而給予高劑量H-IgG治療后，補(bǔ)體C3的活性被顯著的抑制。結(jié)論： （1）在新生大鼠HI模型中，可以引起缺氧缺血性腦損傷的最低缺氧時(shí)間為1小時(shí)，損傷程度隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加重。2h HI可以產(chǎn)生較穩(wěn)定的腦損傷模型。 （2）H-IgG對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷具有保護(hù)作用： 1．H-IgG的腦保護(hù)作用具有劑量依賴性：高劑量H-IgG（2.0g/kg）對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷具有明顯的腦保護(hù)作用；中等劑量H-IgG（1.0g/kg）對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷也具有一定的腦保護(hù)作用，但效果不如高劑量H-IgG組。 2．H-IgG的腦保護(hù)作用具有時(shí)間依賴性：缺氧前1小時(shí)給藥與缺氧后1小時(shí)給藥均具有腦保護(hù)作用。 （3）H-IgG不僅對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷急性期具有腦保護(hù)作用，而且對(duì)于缺氧缺血性腦損傷的新生大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育障礙也具有明顯的改善。 （4）H-IgG對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的腦保護(hù)作用可能是通過(guò)清除補(bǔ)體C3b，從而抑制炎癥反應(yīng)。 總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立出生后7天新生大鼠缺氧缺血模型，證實(shí)了高劑量的H-IgG對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷具有顯著的腦保護(hù)作用，為治療新生兒缺氧缺血性腦損傷及相關(guān)疾病提供了新的思路。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R722.12

【參考文獻(xiàn)】

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1 張婷;馬杰;;顱內(nèi)蛛網(wǎng)膜囊腫的診斷與治療新進(jìn)展[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2010年02期

本文編號(hào)：2380084