【摘要】：先天性心臟病(以下簡(jiǎn)稱先心病)是常見(jiàn)的出生缺陷之一,在新生嬰兒中發(fā)病率約6%0～9%0,是1歲以內(nèi)嬰兒死亡的主要原因。WHO資料顯示,全球每年約有150萬(wàn)先心病患兒出生,其中,我國(guó)每年約有15萬(wàn)～20萬(wàn)先心病患兒出生。圓錐動(dòng)脈干畸形是由于胚胎期圓錐動(dòng)脈干發(fā)育異常所導(dǎo)致的一類(lèi)紫紺型先心病,約占全部先心病的30%。而其中法洛四聯(lián)癥是最為常見(jiàn)的圓錐動(dòng)脈干畸形之一,約占先心病的10%。法洛四聯(lián)癥患兒自然預(yù)后不佳,若未及時(shí)診治則大多在成年期前死亡,即使手術(shù)糾治仍將存在一些殘余問(wèn)題而影響生活質(zhì)量,給社會(huì)和家庭造成較大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。因此,對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究,對(duì)于開(kāi)展產(chǎn)前咨詢和預(yù)后預(yù)測(cè)等具有重要意義。 作為哺乳動(dòng)物心臟中最主要的間隙連接蛋白,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已顯示Connexin43(Cx43)可能是圓錐動(dòng)脈干畸形遺傳易感性的候選基因,但尚未在人類(lèi)法洛四聯(lián)癥中得到證實(shí)。本研究通過(guò)檢測(cè)法洛四聯(lián)癥患兒的Cx43基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子序列、右室流出道心肌組織中Cx43蛋白和mRNA的表達(dá)水平及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制,探討人類(lèi)法洛四聯(lián)癥與候選易感基因Cx43的關(guān)系,以及Cx43基因究竟在哪些環(huán)節(jié)上參與法洛四聯(lián)癥發(fā)病機(jī)制。本研究不僅可部分闡明Cx43基因在人類(lèi)法洛四聯(lián)癥發(fā)病機(jī)制中的作用,而且可為其他出生缺陷的研究提供可借鑒的研究思路和研究方法。 第一部分法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)DNA序列分析 目的： 檢測(cè)法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因的編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)序列變化,分析其在法洛四聯(lián)癥發(fā)病中的作用。 方法： 應(yīng)用PCR技術(shù)以及測(cè)序方法,對(duì)200例法洛四聯(lián)癥患兒、200例心臟結(jié)構(gòu)正常的健康兒童,對(duì)Cx43基因編碼區(qū)和其啟動(dòng)子區(qū)(上游5’一非編碼區(qū)前2000bp左右)的堿基序列進(jìn)行測(cè)序。對(duì)Cx43基因序列變化與法洛四聯(lián)癥的關(guān)系進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1.有2例患兒編碼區(qū)分別存在1個(gè)突變位點(diǎn),分別為c.G455A,c.G716A,均為雜合突變,但未引起氨基酸序列改變。 2.在啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)病例組有4個(gè)突變位點(diǎn),分別為T(mén)-153C、T-157C、T-266C和A-1462G,其中T-266C突變存在于2例患兒中,T-153C、T-157C和A-1462G突變分別存在于另3例患兒中。啟動(dòng)子區(qū)域還存在11個(gè)多態(tài)位點(diǎn),其中4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(包括T-1032C、G-1415A、T-1478C、C-1569T)在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中未查到,可能為中國(guó)人群特有的多態(tài)位點(diǎn),其等位基因和基因型分布在病例組和對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)；另外7個(gè)多態(tài)位點(diǎn)分別為C-284T(rs9597379)、 A-416C (rs2071166)、G-535A(rs2071165)、G-925C(rsl925223) A-1408G(rs75153918)、G-1431GA(rs73532207)、T-1958C(rs37631741)。其中-1431位點(diǎn)G、A等位基因的分布在兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2=0.698,P=0.034),-1958位點(diǎn)TT/TC/CC基因型分布在兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.047)。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)-1431位點(diǎn)下游65bp存在Nkx2-5結(jié)合位點(diǎn)。 小結(jié)： 1.法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因編碼區(qū)突變少見(jiàn) 2.法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因啟動(dòng)子區(qū)多個(gè)位點(diǎn)突變以及SNP改變可能影響了一些重要轉(zhuǎn)錄因子如Nkx2-5結(jié)合,從而成為其參與TOF發(fā)病的重要環(huán)節(jié) 第二部分法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織Cx43基因的表達(dá)研究 目的： 檢測(cè)法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因mRNA和蛋白水平表達(dá)情況,探討其表達(dá)異常在法洛四聯(lián)癥發(fā)病中的作用。 方法： 選取30例法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織作為研究對(duì)象,以10例與之年齡和性別相匹配的非心源性死亡兒童右室流出道心肌組織為對(duì)照,應(yīng)用Real-time PCR和免疫組化的方法檢測(cè)Cx43基因在法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p=0.0006)。 2.法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因紊亂分布于細(xì)胞膜和胞漿,而規(guī)則分布于正常心肌組織細(xì)胞閏盤(pán)連接處；Cx43蛋白水平表達(dá)同樣高于對(duì)照組。 小結(jié)： 法洛四聯(lián)癥患兒可能存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控異常,導(dǎo)致Cx43mRNA和蛋白水平表達(dá)均明顯增高。Cx43異常分布和高表達(dá)可能影響了心臟發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移以及一些重要信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)傳導(dǎo),導(dǎo)致右室流出道梗阻等表型異常。 第三部分TOF患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究 目的： 檢測(cè)法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)甲基化水平、Cx43基因相關(guān)microRNAs表達(dá)水平以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平,探討法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因表達(dá)增高原因及其參與法洛四聯(lián)癥發(fā)病的環(huán)節(jié)。 方法： 選取30例法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織作為研究對(duì)象,以8例與之年齡和性別相匹配的非心源性死亡兒童右室流出道心肌組織為對(duì)照,應(yīng)用MassARRAY高通量檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子甲基化水平,同時(shí)應(yīng)用Luciferase(?)(?)告基因驗(yàn)證有差異的甲基化位點(diǎn)的功能；應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)與Cx43基因相關(guān)的10個(gè)microRNAs表達(dá)水平,同時(shí)應(yīng)用PCR和測(cè)序方法對(duì)Cx43基因3’UTR區(qū)microRNA結(jié)合位點(diǎn)：進(jìn)行序列分析；應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)Cx43基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與對(duì)照相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)；第一內(nèi)含子內(nèi)一段增強(qiáng)子區(qū)3個(gè)CpG點(diǎn)的甲基化水平明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.007)。體外實(shí)驗(yàn)證明將含有增強(qiáng)子區(qū)域的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,其Luciferase活性明顯上調(diào)(3.36倍)；而將增強(qiáng)子進(jìn)行體外甲基化處理后再次轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,其Luciferase活性明顯下調(diào)(60%)。 2.法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中miR-1(P=0.0001), miR-206(p=0.0112)表達(dá)明顯低于對(duì)照組；而miR-130a、miR-19a、miR-30a、miR-30c、 miR-30d和miR-130b表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)；miR-30e,miR-144在右室流出道心肌組織中不表達(dá)。對(duì)法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因3’UTR區(qū)miR-1/miR-206結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序未發(fā)現(xiàn)突變和差異分布的多態(tài)位點(diǎn)。 3.法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Nkx2-5、p53表達(dá)水平與對(duì)照相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 小結(jié)： 1.法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因增強(qiáng)子區(qū)存在異常低甲基化,提示增強(qiáng)子區(qū)的低甲基化可能影響了某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平導(dǎo)致其右室流出道心肌組織Cx43mRNA水平異常高表達(dá)。 2.法洛四聯(lián)癥患兒存在miR-1、miR-206表達(dá)降低,推測(cè)miR-1和miR-206可能作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式,在轉(zhuǎn)錄后水平導(dǎo)致其右室流出道心肌組織中Cx43蛋白水平異常高表達(dá)。 3.法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因表達(dá)增高可能與轉(zhuǎn)錄因子Nkx2-5、p53表達(dá)水平無(wú)關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R725.4

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本文編號(hào)：2360020