【摘要】：第一部分膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1表達(dá)水平與凋亡的相關(guān)性 研究目的：髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(TREM-1)分子是主要表達(dá)于外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面的受體,能夠放大Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和Nod樣受體(Nod-like receptors, NLRs)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),在膿毒癥等炎癥性疾病發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮重要作用。但是TREM-1在膿毒癥單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞凋亡中的作用尚未明確。因此,本部分研究通過(guò)檢測(cè)膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TREM-1的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率,分析細(xì)胞TREM-1的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性。 研究方法： 本研究納入2012年7月1日至2012年9月4日大學(xué)附屬醫(yī)院外科ICU新入院膿毒癥患者為研究組,排除化療、艾滋病、激素治療和器官移植等患者。所有納入患者在入住重癥監(jiān)護(hù)病房(Intensive Care Unit, ICU)24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行APACHE Ⅱ (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ)評(píng)分和SOFA(Sequential Organ Failure Assessment)評(píng)分。所有納入患者在入住ICU24小時(shí)內(nèi)均抽取全血檢測(cè)全血中單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的凋亡水平；同時(shí)將全血中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分離,檢測(cè)兩種細(xì)胞TREM-1的表達(dá)水平。分別分析單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平與其凋亡率的相關(guān)性。 研究結(jié)果： 本研究共納入外科ICU中符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的26例患者。在原發(fā)疾病中最常見的為急性腹膜炎(26.9%)和肺炎(26.9%),其他還包括急性化膿性梗阻性膽管炎和急性重癥胰腺炎等。其中16例患者細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性,另外10例患者存在臨床感染證據(jù)。所有患者的外周血單核細(xì)胞都檢測(cè)到TREM-1表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率,相關(guān)性分析顯示單核細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平和單核細(xì)胞凋亡率成負(fù)相關(guān)(r=-0.49,P=0.01)。此外,26例患者中有22例成功檢測(cè)到中性粒細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞凋亡率,4例患者檢測(cè)失敗。中性粒細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞凋亡率之間無(wú)顯著相關(guān)性(r=-0.28,P=0.21)。 研究結(jié)論： 膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平與單核細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān),中性粒細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著相關(guān)性。研究結(jié)果提示：TREM-1在單核細(xì)胞抗凋亡中可能具有重要作用。 第二部分TREM-1在單核細(xì)胞凋亡中的作用并初步探討其分子機(jī)制 研究目的： 通過(guò)構(gòu)建攜帶TREM-1基因的重組腺病毒表達(dá)載體,獲得高表達(dá)TREM-1的單核細(xì)胞,進(jìn)行TREM-1在單核細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制的研究,探討Erk和PI3K/Akt通路和Bcl-2蛋白家族在該凋亡機(jī)制中的作用。研究方法： 構(gòu)建高表達(dá)TREM-1的腺病毒表達(dá)載體,感染單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞,用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TREM-1蛋白的表達(dá)水平。以高表達(dá)TREM-1的THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象,采用激動(dòng)性抗體激活TREM-1通路,或同時(shí)用100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激,隨后用星形孢菌素(staurosporine, STS)誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。采用化學(xué)抑制試驗(yàn)觀察細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal-regulated kinase, Erk)通路和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/Akt通路對(duì)TREM-1分子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。采用Western blot法技術(shù)檢測(cè)Bcl-2蛋白家族在TREM-1分子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的表達(dá)水平變化。 研究結(jié)果： Western-blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)TREM-1重組腺病毒載體構(gòu)建成功,能在單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。激活TREM-1通路能顯著降低STS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的凋亡率(41.8%vs.63%,p0.05),且在LPS刺激誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞(體外炎癥模型)中也得到了相似的結(jié)果(33.7%vs.54.3%,p0.05)。用化學(xué)藥物抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal-regulated kinase, Erk)或磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/Akt通路的活化,能夠減弱TREM-1對(duì)THP-1凋亡的抑制作用(Erk抑制劑：29.8%vs.77.7%, p0.05; PI3K/Akt抑制劑：29.8%vs.69.3%, p0.05)。Western blot結(jié)果顯示TREM-1的激活不僅能顯著地提高Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)的表達(dá),而且還能逆轉(zhuǎn)STS對(duì)Mcl-1蛋白的抑制作用(p0.05)。 研究結(jié)論： 本研究證實(shí)激活TREM-1對(duì)單核細(xì)胞具有抗凋亡作用,其機(jī)制可能與Erk和Akt信號(hào)通路的激活、以及下游抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)升高有關(guān)。 第三部分明確Mcl-1分子在TREM-1介導(dǎo)單核細(xì)胞抗凋亡通路中的重要作用 研究目的： 探討上述研究中發(fā)現(xiàn)的髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)蛋白在單核細(xì)胞TREM-1抗凋亡通路中的確切作用,從而明確單核細(xì)胞表面TREM-1分子在細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)控中的重要作用。 研究方法： 以高表達(dá)TREM-1的THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象,采用化學(xué)抑制劑抑制TREM-1通路的下游分子Erk和Akt,Western blot方法檢測(cè)Mcl-1蛋白水平的變化。采用激動(dòng)性TREM-1抗體激活TREM-1受體后,加入特異性抑制Mcl-1蛋白表達(dá)的Roscovitine (20μM)與0.6μg/ml STS,流式細(xì)胞術(shù)觀察Mcl-1蛋白抑制后對(duì)TREM-1發(fā)揮抗凋亡作用的影響。 研究結(jié)果： 抑制Erk和/或Akt信號(hào)分子均導(dǎo)致Mcl-1蛋白表達(dá)顯著下降(p0.05)。20μM Roscovitine處理4小時(shí)后,TREM-1-THP-細(xì)胞的Mcl-1蛋白表達(dá)明顯被抑制(p0.05)。將激活TERM-1通路的TREM-1-THP-1細(xì)胞用20μM Roscovitine處理后,TREM-1的抗凋亡作用被抑制(68.1%vs.39.5%,p0.05)。 研究結(jié)論： 本研究證實(shí)TREM-1可能是通過(guò)激活的Erk和Akt通路上調(diào)Mcl-1蛋白發(fā)揮抗凋亡作用,Mcl-1蛋白可能是TREM-1抗凋亡通路中的重要分子。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R720.597

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2317774