發(fā)布時(shí)間：2018-07-20 13:25

【摘要】：腸道病毒71型(EV71)為單正鏈的RNA病毒,小核糖核酸病毒科,腸道病毒屬。EV71是引起小兒手足口病的常見(jiàn)病原體,重癥感染可引起腦干腦炎、腦脊髓炎及急性遲緩性麻痹等嚴(yán)重并發(fā)癥。自2008年以來(lái),EV71在我國(guó)大陸多省市持續(xù)的暴發(fā)流行,導(dǎo)致數(shù)百嬰幼兒死亡,已造成嚴(yán)重的社會(huì)危害。 病毒感染細(xì)胞的首要環(huán)節(jié)是其表面特定的配體與宿主細(xì)胞膜表面特異性受體的識(shí)別吸附。此外,先天免疫系統(tǒng)對(duì)于識(shí)別病毒感染及激活隨后的適應(yīng)性免疫應(yīng)答有至關(guān)重要的作用,目前研究發(fā)現(xiàn)的三種模式識(shí)別受體：RLRs, TLRs以及NLRs,這些受體能夠識(shí)別病毒感染后產(chǎn)生的非自身的核酸成分,通過(guò)招募下游的接頭蛋白,激活Ⅰ型干擾素及細(xì)胞因子的產(chǎn)生,發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。其中,多種細(xì)胞系(非免疫細(xì)胞)利用RLRs識(shí)別RNA病毒的感染,而pDC利用TLRs識(shí)別病毒的入侵,NLRs在識(shí)別ssRNA病毒感染方面發(fā)揮一定作用。然而,并不是只要有病毒進(jìn)入細(xì)胞就能夠引起抗病毒免疫的過(guò)程,激發(fā)有效抗病毒先天免疫的兩個(gè)主要的條件是：1)宿主免疫系統(tǒng)具有有效識(shí)別入侵病毒的受體；2)觸發(fā)干擾素級(jí)聯(lián)反應(yīng)的蛋白系統(tǒng),這二者缺一不可。 2009年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)EV71感染上皮細(xì)胞的特異性受體為SCARB2,在不易感的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SCARB2可明顯促進(jìn)病毒的感染。在本實(shí)驗(yàn)中,我們首先對(duì)不同細(xì)胞系細(xì)胞表面受體高低水平與病毒感染能力的相關(guān)性進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EV71對(duì)于細(xì)胞表面受體水平較低的細(xì)胞難以感染,但對(duì)于受體表達(dá)均處于較高水平且表達(dá)量基本一致的不同細(xì)胞系,EV71對(duì)其感染能力卻存在巨大的差異。例如對(duì)EV71非常易感的RD細(xì)胞及較難感染的HeLa細(xì)胞,其細(xì)胞表面SCARB2表達(dá)水平基本一致,但病毒產(chǎn)率卻相差2個(gè)log以上。究其原因,我們用生物素標(biāo)記的病毒進(jìn)行病毒吸附實(shí)驗(yàn),用ELISA方法對(duì)吸附病毒進(jìn)行定量檢測(cè),發(fā)現(xiàn)EV71對(duì)RD及HeLa這兩種細(xì)胞吸附能力相同,流式細(xì)胞術(shù)也進(jìn)一步證實(shí)了這一現(xiàn)象,從而排除細(xì)胞表面因素的影響,進(jìn)一步探討胞內(nèi)主要發(fā)揮抗病毒作用的蛋白——RIG-I、MDA5、NOD2及MAVS等的表達(dá)水平,結(jié)果顯示RD細(xì)胞內(nèi)源性RIG-I表達(dá)水平特別低,并且不能有效誘導(dǎo)干擾素相關(guān)抗病毒基因ISGs等的表達(dá)。為進(jìn)一步證實(shí)RIG-I在EV71感染中的作用,在內(nèi)源性水平低的RD細(xì)胞過(guò)表達(dá)HA-RIG-I,可明顯抑制病毒的感染,反之,在表達(dá)水平高的HeLa細(xì)胞內(nèi)用siRNA干擾RIG-I的表達(dá)可明顯增加病毒的感染,且具有劑量依賴性。 綜上：病毒對(duì)細(xì)胞的感染能力受細(xì)胞表面特異性受體及胞內(nèi)天然免疫通路雙重調(diào)控,具體來(lái)講,對(duì)于手足口病病毒EV71,除了SCARB2這一細(xì)胞表面特異性受體外,胞內(nèi)天然免疫通路中主要識(shí)別RNA病毒感染的蛋白R(shí)IG-I的表達(dá)水平也決定了病毒對(duì)細(xì)胞的感染能力。
[Abstract]:Enterovirus 71 (EV71) is a single-stranded RNA virus, small ribonucleic acid virus family, enterovirus. EV71 is a common pathogen of hand, foot and mouth disease in children. Severe infection can cause brainstem encephalitis. Severe complications such as encephalomyelitis and acute delayed paralysis. Since 2008, the outbreak of EV71 in many provinces and cities of China has caused hundreds of infant deaths and caused serious social harm. The first step of viral infection is the recognition and adsorption of specific ligands on the surface of the cell surface and specific receptors on the surface of the host cell membrane. In addition, the innate immune system plays a crucial role in identifying viral infections and activating subsequent adaptive immune responses. Three types of pattern recognition receptors, namely: RLRRs, TLRs and NLRss, have been found to recognize non-self-contained nucleic acids produced by virus infection and activate the production of interferon type I and cytokines by recruiting downstream junction proteins. Give play to the antiviral effect. Among them, many cell lines (non-immune cells) use RLRs to recognize RNA virus infection, while pDC uses TLRs to recognize the invasion of virus and NLRs play a role in the identification of ssRNA virus infection. However, it is not possible to induce antiviral immunity as long as viruses enter the cells. The two main conditions for triggering effective innate antiviral immunity are: 1) the host immune system has an effective receptor to recognize invading viruses; In 2009, Japanese researchers found that the specific receptor of EV71 infected epithelial cells was SCARB2, and that overexpression of SCARB2 in unsusceptible cells could significantly promote the infection of the virus. 2) the protein system that triggers the cascade reaction of interferon is indispensable. In 2009, Japanese researchers found that the specific receptor of EV71 infected epithelial cells was SCARB2. In this experiment, we first analyzed the relationship between the cell surface receptor level and virus infection ability in different cell lines. The results showed that it was difficult to infect cells with lower cell surface receptor level. However, there were great differences in the infection ability of different cell lines (EV71) with high level of receptor expression and similar expression levels. For example, the expression level of SCARB2 on the surface of Rd cells, which is very susceptible to EV71, and HeLa cells, which are difficult to infect, is basically the same, but the virus yield is more than two log. The reason is that we used biotin labeled virus to carry out virus adsorption test and Elisa method to quantitatively detect the adsorbed virus. We found that EV71 has the same adsorption ability to Rd and HeLa cells, and flow cytometry further confirmed this phenomenon. In order to eliminate the effect of cell surface factors, the expression levels of RIG-Igna MDA5NOD2 and MAVs were further investigated. The results showed that the expression of endogenous RIG-I was very low in Rd cells, and the expression level of RIG-I was very low in Rd cells. Moreover, it can not effectively induce the expression of interferon-associated antiviral genes such as ISGs. In order to further confirm the role of RIG-I in EV71 infection, overexpression of HA-RIG-I in Rd cells with low endogenous level could significantly inhibit virus infection, whereas siRNA interference with RIG-I expression in HeLa cells with high expression level could significantly increase virus infection. And it is dose dependent. In conclusion, the ability of virus to infect cells is regulated by cell surface specific receptor and intracellular innate immune pathway. Specifically, for HFMD virus EV71, in addition to SCARB2, a cell surface specific receptor, The expression level of RIG-I, which mainly recognizes RNA virus infection in intracellular innate immune pathway, also determines the ability of virus to infect cells.
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R725.1

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本文編號(hào)：2133672