發(fā)布時間：2018-06-07 03:25

  本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞 + 誘導(dǎo)分化　； 參考：《青島大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia,ITP)是一種常見的自身免疫性出血性疾病,目前尚無有效的治療策略,其中慢性難治性ITP有較高死亡率,因治療疾病本身的影響及治療相關(guān)并發(fā)癥,患者生活質(zhì)量差,盡管國內(nèi)外學(xué)者對ITP治療進行了大量基礎(chǔ)與臨床研究,這些問題仍然沒有得到有效解決,因此尋找新的治療策略以克服當(dāng)前治療方法的不足,成為當(dāng)今研究的熱點,其中間充質(zhì)干細(xì)胞有可能成為一個選擇,但是相關(guān)的研究資料很少,尚不能為臨床治療提供充足的理論依據(jù)。本研究旨在建立一種穩(wěn)定、高效的從小鼠骨髓中分離間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)的方法,并通過對其基本的生物學(xué)特性,免疫表型、多向分化潛能及對ITP小鼠模型的治療作用和其可能的作用機制的研究,以期進一步了解BM-MSCs的生物學(xué)特性和臨床應(yīng)用的實際價值,為ITP的治療提供新的研究方向。方法:本實驗研究分為3部分:1、取健康6周C57/BL6小鼠采用頸脫臼法處死,然后分離四肢骨,用PBS沖洗骨髓腔收集骨髓,離心去上清,將采集的骨髓液全部投入培養(yǎng)基中,利用間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長的特性,采用全骨髓貼壁法培養(yǎng),多次換液分離出貼壁細(xì)胞,并通過傳代培養(yǎng)進行細(xì)胞的純化和擴增,在倒置相差顯微鏡下對細(xì)胞生長形態(tài)進行觀察拍照;取P3代MSCs,用流式細(xì)胞儀進行MSCs免疫表型分析;取一定數(shù)量P3代細(xì)胞分別在脂肪和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中向成脂、成骨誘導(dǎo)分化,誘導(dǎo)一定時間后采用茜素紅及油紅O染色進行染色鑒定,以觀察其多向分化的潛能。2、頸椎脫臼法處死8周齡雄性WTC57BL6小鼠,采用眼球摘除法取血,離心收集富含血漿的血小板,并將1×108的血小板通過尾靜脈注射入CD61KO小鼠體內(nèi),輸入血小板后通過測CD61KO小鼠血清內(nèi)anti-CD61 Ig G含量,了解免疫是否成功,免疫成功后處死小鼠取其脾臟,研碎制成脾細(xì)胞懸液,在6h內(nèi)把5×104個上述收集的脾細(xì)胞腹腔注射經(jīng)過200c Gy射線照射全身的重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠,通過檢測SCID小鼠的血小板變化來判斷血小板減少水平,以建立穩(wěn)定的小鼠ITP模型。3、將雄性SCID小鼠分為3組:SCID小鼠對照1組(未處理組)、對照2組(ITP組)、實驗組(ITP+BM-MSCs組),實驗組給予輸注1×106個MSCs,對照組給予同等體積的生理鹽水輸注,輸注后在4d、8d、12d、16d測不同組小鼠血小板水平、并分別在第7d、14d、21d天每組隨機處死3只小鼠,檢測不同組小鼠外周血和脾臟Treg水平,同時測7d時三組小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的變化。結(jié)果:1、全骨髓貼壁法分離間充質(zhì)干細(xì)胞成功率100%,倒置顯微鏡下細(xì)胞呈形態(tài)均一的梭形,成平行或旋渦狀生長;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示貼壁細(xì)胞均高表達CD105、CD90及CD73,不表達造血細(xì)胞表型CD34、CD45和HLA-DR;成脂、成骨誘導(dǎo)多向分化潛能中,成脂誘導(dǎo)14d,可見大量脂滴形成,油紅O染色呈強陽性,成骨誘導(dǎo)21d,茜素紅染色可見礦化結(jié)節(jié)形成。2、CD61KO小鼠輸入來自WTC57BL6純化的血小板后,anti-CD61 Ig G的濃度在第14天上升至最高(39.14%±3.68%),至第28天Ig G+濃度均維持在較高水平(Ig G+30%)(44.45%±3.91%);經(jīng)射線照射全身后的SCID小鼠在接受CD61KO小鼠重新免疫后的脾細(xì)胞后,血小板呈持續(xù)下降,在第7d、第14d、21d及28d血小板水平分別為(401.25±65.34)×109/L、(336.38±60.19)×109/L、(267.38±59.58)×109/L和(209.63±19.62)×109/L,和對照組2比較血小板水平升高明顯,具有顯著性差異(P0.01)。3、實驗組小鼠在輸入1×106個MSCs后,第4d、第8d、12d及16d血小板水平分別為(606.11±76.16)×109/L、(611.11±67.85)×109/L、(608.56±47.59)×109/L和(600.44±64.68)×109/L,和對照組2比較血小板水平升高明顯,具有顯著性差異(P0.01);實驗組小鼠脾臟Treg細(xì)胞水平在第7d、第14d及21d分別為2.49%±0.03%、2.67%±0.04%及3.00%±0.02%,對照2組脾臟Treg細(xì)胞水平在第7d、第14d及21d分別為0.79%±0.03%、0.62%±0.07%及0.40%±0.04%,實驗組小鼠脾臟Treg細(xì)胞水平明顯高于對照2組,兩者具有顯著性差異(P0.01);實驗組小鼠外周血Treg細(xì)胞水平在第7d、第14d及21d分別為1.84%±0.07%、2.46%±0.31%及3.23%±0.23%,對照2組外周血Treg細(xì)胞水平在第7d、第14d及21d分別為0.68%±0.05%、0.52%±0.04%及0.37%±0.08%,實驗組小鼠外周血Treg細(xì)胞水平明顯高于對照2組,兩者具有顯著性差異(P0.01);輸注后d7天測各組小鼠細(xì)胞因子水平,其中對照1組和對照2組血清IL-2水平分別為(30.44±3.97)pg/ml及(42.33±7.94)pg/m L,對照1組小鼠血清IL-2低于對照2組,兩者具有顯著性差異(P0.01);對照1組和對照2組血清IFN-γ水平分別為(132.44±9.15)pg/ml及(153.22±6.96)pg/m L,對照2組小鼠血清IFN-γ高于對照1組,兩者具有顯著性差異(P0.01);對照1組和對照組2血清IL-4水平分別為(52.76±6.89)pg/ml及(39.33±2.12)pg/m L,對照1組小鼠血清IL-4水平高于對照2,兩者具有顯著性差異(P0.01);對照1組和對照2組血清IL-10水平分別為(68.11±3.48pg)pg/ml及(48.00±4.82)pg/m L,對照1組小鼠血清IL-10水平高于對照2組,兩者具有顯著性差異(P0.01);;實驗組血清IL-2水平和對照2組相比顯著降低(實驗組:39.78±5.78pg/m L,t=2.50,P0.01);實驗組IFN-γ的水平和對照2組相比顯著降低(實驗組143.67±9.18pg/m L,t=2.49,P0.01);實驗組血清IL-4水平和對照2組相比顯著升高(實驗組42.22±2.91pg/m L,t=-2.83,P0.01);實驗組IL-10水平和對照2組相比顯著升高(實驗組55.11±6.74pg/m L,t=-2.58,P0.01)。結(jié)論:1、全骨髓貼壁培養(yǎng)法是一種操作簡單、高效的分離小鼠BM-MSCs方法,使骨髓作為一個細(xì)胞治療可靠的來源,有利于MSCs基礎(chǔ)與臨床臨用,值得進一步推廣應(yīng)用。2、成功建立了一種制備血小板自身抗體的一種簡易方法,可用于對血小板發(fā)病機制及治療的進一步研究。成功建立了一種ITP小鼠模型,該模型一定程度上模擬了ITP的發(fā)病機制,克服了其他方法造模的穩(wěn)定性差及可能同時伴發(fā)其他免疫性疾病等的缺點,為進一步探討ITP的治療提供了良好的平臺。3、BM-MSCs治療可以升高ITP小鼠血小板水平,對小鼠ITP治療具有一定的效果。其有效的治療機制可能是由于BM-MSCs可調(diào)節(jié)Treg水平和抑制Th1細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子,促進Th2細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子有關(guān),調(diào)節(jié)Treg分化及Th細(xì)胞極化,提示MSCs有望成為難治性ITP治療性新途徑。BM-MSCs用于治療ITP的詳細(xì)分子機制還需要進一步的研究探討,從而為MSCs治療ITP奠定臨床前治療理論依據(jù)。
[Abstract]:Objective : To study the biological characteristics of bone marrow derived mesenchymal stem cells ( BM - MSCs ) in mice . The mice were divided into three groups : SCID mice control group 1 ( untreated group ) , control group ( ITP + BM - MSCs ) . The levels of anti - CD61 Ig G were ( 61.11 鹵 6.16 ) 脳 109 / L , ( 608.56 鹵 47.59 ) 脳 109 / L , ( 608.56 鹵 47.59 ) 脳 109 / L , ( 608.56 鹵 47.59 ) 脳 109 / L , ( 608.56 鹵 47.59 ) 脳 109 / L , ( 604.38 鹵 19.62 ) 脳 109 / L , respectively . The levels of Treg cells in the spleen of experimental group were significantly higher than those in control group ( P 0.01 ) . The levels of serum IL - 2 and IL - 4 in the control group were significantly lower than those in the control group ( P 0.01 ) . The levels of serum IL - 2 in the control group were ( 52.76 鹵 9.15 ) pg / ml and ( 42.33 鹵 4.82 ) pg / ml and ( 42.33 鹵 4.82 ) pg / ml respectively . The levels of IL - 4 in the control group were significantly higher than those in the control group ( experimental group : 42.22 鹵 2.91pg / ml , t = - 2.83 , P0.01 ) . Conclusion : 1 . The bone marrow adherent culture method is a simple and effective method for separating mouse BM - MSCs , which can be used as a reliable source for the treatment of ITP .
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R725.5;R-332

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4 上海生科院 上海交大醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所 曹楷;間充質(zhì)干細(xì)胞：干細(xì)胞中的孫悟空[N];上�？萍紙�;2014年

5 記者　陳建強;首家間充質(zhì)干細(xì)胞庫在津建成[N];光明日報;2006年

6 記者　馮國梧;細(xì)胞產(chǎn)品國家工程中心建設(shè)方案獲準(zhǔn)[N];科技日報;2007年

7 實習(xí)生 劉霞;間充質(zhì)干細(xì)胞有望用于面部整形[N];科技日報;2007年

8 本報記者 王新佳;我國“原始間充質(zhì)干細(xì)胞”注射液進入臨床研究[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2005年

9 馮國梧;全球首個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫規(guī)模化運營[N];科技日報;2008年

10 劉瑩清;全球首個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫泰達規(guī)模運營[N];北方經(jīng)濟時報;2008年

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本文編號：1989538