本文選題：急性呼吸道感染 + 呼吸道病原體　； 參考：《廣州醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的急性呼吸道感染(ARI)一直是困擾人類最常見、發(fā)生率最高的疾病,其病原復(fù)雜多樣,且很難從癥狀上判斷感染種類。廣州由于其特殊的地理位置,濕熱的氣候,緊鄰東南亞,國內(nèi)外人員活動頻繁的特點一直是各種呼吸道病原體的活動溫床,而呼吸道病原體的精確診斷和流行病學(xué)研究對疾病防治具有重要意義。方法(1)本研究采集2009.7至2016.6廣州ARI患者(≤14歲)咽拭子,采用熒光定量PCR方法檢測18種常見呼吸道病原體,并收集期間廣州氣象數(shù)據(jù)包括月平均氣溫、平均相對濕度、平均風(fēng)速,平均氣壓、平均水汽壓及日照時數(shù),分析病原體在廣州地區(qū)的流行規(guī)律及其與氣候因素的相關(guān)性;(2)根據(jù)RSV M2-1轉(zhuǎn)錄抗終止因子作用,將M2-1克隆至pcDNA3.1(+),通過轉(zhuǎn)染、篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)M2-1的Hep-2細(xì)胞株,并對穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的生長特性及RSV感染特性進行分析;(3)以Taqman熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ),以RSV-A、RSV-B的G基因特異保守區(qū)、管家基因ACTB設(shè)計引物探針建立多重?zé)晒舛縋CR,通過多種呼吸道病原體驗證其特異性,以體外轉(zhuǎn)錄的RNA驗證其靈敏度并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。對2013.1至2015.12期間廣州ARI患者(≤14歲)咽拭子進行RSV-A、RSV-B檢測并收集病歷信息,首次采用相對病毒載量CVL方法進行呼吸道樣品的病毒定量,分析廣州地區(qū)感染RSV-A/RSV-B的流行狀況及患者臨床表現(xiàn),探討利用內(nèi)參基因進行相對定量分析的可行性。結(jié)果(1)本研究在七年間收集11399例ARI患者咽拭子,對其進行18種常見呼吸道病原體檢測。49.2%(5606/11399)的患者檢測出一種或多種病原體陽性,在陽性患者中,檢出率最高的為RSV(1690/5606,30.1%)、infA(839/5606,15.0%)、MP(760/5606,13.6%)、ADV(621/5606,11.1%)、HRV(402/3789,10.6%),接著是OC43、HMPV、infB、PIV3、HBoV,陽性率6.2%-4.4%,剩余的7種病原體PIV1,CP,PIV2,229E,NL63,HKU1,PIV4的陽性率均低于4.0%。病原體在不同年齡患者中分布有四種模式:1)陽性率隨著年齡的增大而減少,包括RSV(p0.001);2)隨著年齡增大而增多,包括infA和infB(p0.001);3)在0-14歲患者中發(fā)現(xiàn)感染高峰,包括EV、HRV、ADV、MP、PIV3、OC43、HBoV、HMPV(p≤0.025);4)無顯著差異或者數(shù)量太少無法統(tǒng)計,包括PIV1、PIV2、PIV4、229E、NL63、HKU1、CP�？傮w來說,隨著季節(jié)更替時,樣本陽性率升高或降低:1)陽性率升高:在6-9月份之間(夏轉(zhuǎn)秋)及4-5月份(春轉(zhuǎn)夏)常有陽性率的高峰;2)陽性率降低:在10-12月份之間(秋轉(zhuǎn)冬)及1-3月份(冬轉(zhuǎn)春)常有陽性率低谷。通過多元線性回歸分析,有顯著線性關(guān)系的有:標(biāo)本陽性率與平均氣溫、平均相對濕度、日照時數(shù)(p≤0.002),RSV與平均相對濕度、日照時數(shù)(p≤0.034),MP與平均氣溫(p=0.003),ADV與日照時數(shù)(p=0.008),EV與平均氣溫、平均相對濕度(p≤0.039),HMPV與日照時數(shù)(p=0.004),PIV3與平均氣溫、平均相對濕度、日照時數(shù)(p≤0.049),HBoV與平均氣溫、平均相對濕度(p≤0.024)。(2)本研究通過pcDNA3.1(+)質(zhì)粒構(gòu)建攜帶M2-1載體,轉(zhuǎn)染并通過篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)RSV M2-1的Hep-2 2F5細(xì)胞,通過對比Hep-2 2F5與原始Hep-2細(xì)胞的生長曲線及培養(yǎng)觀察,Hep-2 2F5增殖速度高于Hep-2;通過對比Hep-2 2F5與原始Hep-2細(xì)胞感染RSV的特點,發(fā)現(xiàn)Hep-2 2F5對RSV更加敏感,更加易感,但其病毒產(chǎn)量低于原始Hep-2細(xì)胞。(3)本研究根據(jù)RSV-A和RSV-B的G基因特異保守區(qū)及ACTB基因建立了多重?zé)晒舛繖z測方法,使用一系列呼吸道病原體檢測無非特異性擴增,RSV-A、RSV-B、ACTB可分別檢測到最低4 copies/μl、8 copies/μl和12 copies/μl的體外轉(zhuǎn)錄RNA模板,并且分別在10 1′1010 copies/μl(r2=0.9973)、100 1′1010 copies/μl(r2=0.9989)和100 1′1010 copies/μl(r2=0.9984)的RNA模板濃度范圍內(nèi)具有很好的線性。在三年時間共收集、檢測5483例ARI患者(≤14歲),總?cè)藬?shù)13.3%(729/5483)的患者為RSV陽性,其中RSV-A、RSV-B分布占51.2%(373/729)和48.8%(356/729)。在2013和2015年各年份主要流行亞型分別為RSV-B和RSV-A,而2014年則是兩種亞型都有流行。在臨床表現(xiàn)上,在RSV-A和RSV-B陽性患者之間發(fā)現(xiàn)在流涕、呼吸困難、細(xì)支氣管炎、寒戰(zhàn)、頭疼、肌痛、乏力、嘔吐、納差、腹瀉、皮疹等(p≤0.01)臨床癥狀的發(fā)生頻率上有顯著差異。不同的RSV CVL患者主要在細(xì)支氣管炎、發(fā)熱(≥38°C)(p≤0.009)的發(fā)生頻率上有顯著差異。結(jié)論(1)本次研究通過在廣州對14歲以下ARI患者18種常見呼吸道病原體及其亞型的七年監(jiān)測分析:1)了解了當(dāng)?shù)爻Ｒ姾粑啦≡w的分布構(gòu)成情況;2)獲得了常見呼吸道病原體在14歲以下患者這個的年齡分布模式;3)獲得了當(dāng)?shù)睾粑啦≡w的季節(jié)分布特點及其與氣候因素的相關(guān)性。(2)本研究根據(jù)其M2-1的功能:1)以Hep-2為基礎(chǔ)構(gòu)建成功穩(wěn)定表達(dá)M2-1的Hep-2 2F5;2)獲得了Hep-2 2F5的生長特點、RSV感染特點;3)為RSV培養(yǎng)分離提供備選細(xì)胞。(3)本研究根據(jù)RSV亞型基因特點及管家基因ACTB:1)建立了新型的RSV亞型多重?zé)晒舛縋CR診斷方法;2)獲得廣州RSV-A、RSV-B的流行病學(xué)資料;3)首次提出使用CVL評價方法進行呼吸道樣品中的病原體定量。本研究在病原體快速診斷、培養(yǎng)分離和流行病學(xué)的工作希望為疾病的防治、臨床診斷、藥物、疫苗開發(fā)等作出一些貢獻(xiàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R725.6

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本文編號：1870447