本文選題：表觀遺傳學(xué) + 宮外生長(zhǎng)遲緩�。� 參考：《浙江大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：生命早期(一般指胎兒期、嬰幼兒期)是生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期,這一階段正是機(jī)體各器官、組織、細(xì)胞分化形成和發(fā)育成熟時(shí)期；該階段可塑性強(qiáng),多數(shù)器官和系統(tǒng)的發(fā)育在這個(gè)“時(shí)間窗”對(duì)環(huán)境敏感且易變,不良應(yīng)激可導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展的易感性增強(qiáng)。 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球每年出生1200多萬早產(chǎn)兒,占新生兒總數(shù)的9.6%。按照我國(guó)目前的出生率和早產(chǎn)發(fā)生率計(jì)算,每年出生約150萬早產(chǎn)兒,占全球早產(chǎn)兒總數(shù)的十分之一以上。宮外生長(zhǎng)遲緩(Extrauterine growth restriction, EUGR)指小兒出生后生長(zhǎng)發(fā)育計(jì)量指標(biāo)在相應(yīng)宮內(nèi)生長(zhǎng)速率期望值的第10百分位水平以下(≤生長(zhǎng)曲線的第10百分位)。EUGR在早產(chǎn)兒中發(fā)生率極高,問題十分突出。 大量的人群流行病學(xué)資料調(diào)查、前瞻性臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,生命早期所處環(huán)境的不良刺激不僅影響出生前和出生后的生長(zhǎng)發(fā)育,而且會(huì)對(duì)成年后的健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生遠(yuǎn)期乃至終生影響,此即成人疾病的胎兒起源假說(fetal origins of adult disease, FOAD)和“發(fā)育起源的健康與疾病”(development origin of Health and disease,DOHaD)學(xué)說。 越來越多的證據(jù)揭示了表觀調(diào)控機(jī)制在發(fā)育起源的健康與疾病中起到重要作用。表觀遺傳學(xué)是研究不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)和調(diào)控的可遺傳修飾,包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA干擾等。檢測(cè)DNA甲基化與組蛋白修飾的表觀遺傳學(xué)方法主要由染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù),以及在經(jīng)過全基因組甲基化芯片芯片初步篩選后,Sequenom特定DNA段甲基化檢測(cè)技術(shù)對(duì)差異甲基化基因位點(diǎn)進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證。目前由于生命早期不良的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境相關(guān)的成人期肺部疾病發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制已經(jīng)有了初步的認(rèn)識(shí),然而,由生命早期營(yíng)養(yǎng)受限所誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓中是否存在表觀遺傳調(diào)控尚不清楚。 鑒于現(xiàn)有的資料,我們假設(shè) 1.生命早期營(yíng)養(yǎng)受限可誘導(dǎo)肺血管功能相關(guān)的基因eNOS的表觀遺傳修飾的改變(DNA甲基化與組蛋白修飾),并且可能存在性別的差異。 2.生命早期營(yíng)養(yǎng)受限所致的成年期肺動(dòng)脈高壓,存在著一系列相關(guān)基因的表觀遺傳修飾的改變。而且這些相關(guān)基因的早期表觀修飾改變可以引起個(gè)體成年期對(duì)外界刺激因素高度敏感,導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)控紊亂,從而發(fā)生肺動(dòng)脈高壓。 這些表觀遺傳修飾改變可以引起個(gè)體對(duì)環(huán)境等刺激因素高度敏感,導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。如果在個(gè)體發(fā)育早期階段給予適當(dāng)?shù)母纱胧?阻止或逆轉(zhuǎn)相關(guān)基因的表觀修飾,可能對(duì)降低成年后發(fā)生肺動(dòng)脈高壓有保護(hù)作用。 第一部分官外生長(zhǎng)遲緩改變肺血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)的表觀調(diào)控機(jī)制 目的： 大量的人群流行病學(xué)資料調(diào)查、前瞻性臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,生命早期所處環(huán)境的不良刺激不僅影響出生前和出生后的生長(zhǎng)發(fā)育,而且會(huì)對(duì)成年后的健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生遠(yuǎn)期乃至終生影響。此即“發(fā)育起源的健康與疾病”(development origin of Health and disease, DOHaD)學(xué)說。目前生命早期不良的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境相關(guān)的成人期疾病發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制已經(jīng)有了初步的認(rèn)識(shí),然而,由生命早期營(yíng)養(yǎng)受限對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚不清楚。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞由內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)產(chǎn)生的一氧化氮(NO)在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病中有重要作用,而內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)是受到表觀遺傳調(diào)控的。本研究的目的是探索在生命早期營(yíng)養(yǎng)不良(EUGR)模型中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS基因的表觀遺傳修飾的改變。 方法： SD大鼠EUGR模型建立,對(duì)哺乳期新生仔鼠進(jìn)行飲食限制,制備EUGR模型。正常對(duì)照組飼養(yǎng)模式：10只仔鼠／窩；EUGR組喂養(yǎng)模式：20只仔鼠／窩。生后21天離乳的雌雄SD大鼠,磁珠激活的細(xì)胞分選技術(shù)(MACS)分離獲得肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(Pulmonary Vascular Endothelial Cell,PVEC)。Real-time PCR和Western blot用于檢測(cè)eNOS基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平；染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)和Sequenom特定DNA段甲基化檢測(cè)技術(shù)用于分析eNOS基因的組蛋白修飾和DNA甲基化的表觀調(diào)控機(jī)制的變化。 結(jié)果： EUGR模型評(píng)估：EUGR組SD大鼠哺乳期生長(zhǎng)速率明顯低于對(duì)照組,生后21天離乳時(shí),體重與對(duì)照組相比明顯下降,降低30%左右。3周的EUGR組雌雄SD大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(PVEC)中,eNOS基因mRNA和蛋白水平明顯低于對(duì)照組；eNOS基因近端啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3K9met3和H3K27met3水平均高于正常對(duì)照組,雄性SD大鼠H3K27met3增加更明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；雌性EUGR組的eNOS基因啟動(dòng)子DNA甲基化比對(duì)照組要高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；然而,雄性SD大鼠的eNOS基因啟動(dòng)子DNA甲基化程度,兩組之間無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 生命早期飲食受限的EUGR模型對(duì)SD大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS基因的表達(dá)有影響。eNOS mRNA和蛋白表達(dá)減少與該基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白“抑制性標(biāo)記物"H3K27met3水平增加密切相關(guān)；雌性EUGR組eNOS基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA高甲基化可能與eNOS mRNA表達(dá)減少有關(guān)。eNOS基因的表觀修飾改變與減少的eNOS基因mRNA和蛋白水平相一致。表觀遺傳調(diào)控可能是EUGR模型中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS基因表達(dá)改變的機(jī)制之一,表觀遺傳調(diào)控的改變存在性別的差異。 第二部分宮外生長(zhǎng)遲緩誘導(dǎo)成年期肺動(dòng)脈高壓肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的表觀調(diào)控機(jī)制 目的： 生后早期是生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期,可塑性強(qiáng),多數(shù)器官和系統(tǒng)的發(fā)育在這個(gè)“時(shí)間窗”對(duì)環(huán)境敏感且易變,不良應(yīng)激可導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展的易感性增強(qiáng)。生命早期營(yíng)養(yǎng)不良不僅可以增加成年期代謝性疾病和心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),還可以導(dǎo)致肺血管張力改變、肺血管重構(gòu),但引起肺血管功能失調(diào)的機(jī)制尚不十分清楚。EUGR在早產(chǎn)兒中發(fā)生率極高,問題十分突出。目前,生命早期營(yíng)養(yǎng)受限相關(guān)的成人期疾病發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制有了初步的認(rèn)識(shí),有研究推測(cè)相關(guān)基因的DNA甲基化與組蛋白修飾異常可能參與生命早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)導(dǎo)致的肺血管功能失調(diào)。而且這些相關(guān)基因的早期表觀修飾改變可以引起個(gè)體成年期對(duì)等外界刺激因素高度敏感,導(dǎo)致肺血管張力調(diào)控紊亂,從而發(fā)生肺動(dòng)脈高壓。本實(shí)驗(yàn)的目的是為了探索EUGR導(dǎo)致的肺血管功能失調(diào)與DNA甲基化與組蛋白修飾異常改變的關(guān)系。 方法： SD大鼠EUGR模型的建立。經(jīng)右側(cè)頸外靜脈進(jìn)行肺動(dòng)脈插管,測(cè)量生后9周EUGR雄性大鼠肺動(dòng)脈平均壓力。分離心臟組織,計(jì)算右心指數(shù)。對(duì)大鼠的肺組織進(jìn)行免疫組化染色,評(píng)價(jià)肺血管重構(gòu)情況。生后9周的雄SD性大鼠,磁珠激活的細(xì)胞分選技術(shù)(MACS)分離獲得肺血管內(nèi)皮細(xì)胞。Western blot用于評(píng)估eNOS蛋白的表達(dá),Real-time RT-PCR技術(shù)用于驗(yàn)證DNA甲基化異常調(diào)節(jié)基因的mRNA表達(dá)水平。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)用于分析eNOS、IGF-1、PPARy基因的組蛋白修飾改變。對(duì)分選的PVECs進(jìn)行全基因組DNA甲基化芯片(MeDIP)分析。Sequenom特定DNA段甲基化檢測(cè)技術(shù)對(duì)差異甲基化基因位點(diǎn)進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證。 結(jié)果： EUGR組雄性大鼠哺乳期到生后9周生長(zhǎng)速率均低于對(duì)照組。9周SD雄性大鼠肺血管功能失調(diào)：肺動(dòng)脈平均壓增高,右心指數(shù)數(shù)值增加,免疫組化結(jié)果肺小動(dòng)脈發(fā)生重構(gòu)。DNA甲基化芯片分析：篩選出來EUGR組與Control組之間DNA甲基化差異表達(dá)基因的近500多個(gè)。Gene Ontology分析：這些發(fā)生高甲基化水平改變的基因多與血管發(fā)育相關(guān)。這些發(fā)生低甲基化水平改變的基因與分化相關(guān)和參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為主。DNA甲基化芯片結(jié)果顯示Fgfr2、RhoC、Notch1呈高甲基化狀態(tài),Fgfr2、RhoC、Notch1三個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平表達(dá)降低。eNOS、 PPARγ、IGF-1基因的mRNA表達(dá)與DNA甲基化狀態(tài)和組蛋白修飾的改變有關(guān)。 結(jié)論 宮外生長(zhǎng)遲緩(EUGR)模型雄性大鼠在成年期可出現(xiàn)肺血管功能失調(diào),主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈平均壓力增高,右心指數(shù)增加,肺血管重構(gòu)。EUGR可導(dǎo)致成年期大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因發(fā)生DNA甲基化異常改變。eNOS、PPARγ、 IGF-1、Notch1、Fgfr2、RhoC等基因表觀遺傳修飾的改變可能是EUGR導(dǎo)致肺血管功能失調(diào)的發(fā)生機(jī)制之一。
[Abstract]:Early life ( usually fetal period , infant stage ) is the key period of growth and development , and this stage is the stage of formation and development of organs , tissues , cell differentiation and development of the organism .
The development of most organs and systems is sensitive to the environment and is easy to change in this time window , which can lead to the occurrence and development of diseases .

According to the World Health Organization , more than 12 million premature infants are born every year , accounting for 9.6 % of the total number of births . According to the current birth rate and the incidence of preterm birth , about 1.5 million premature infants are born each year , accounting for more than one tenth of the total number of premature infants . The growth retardation ( EUGR ) in the uterus is below the 10th percentile of the expected growth rate of the corresponding intrauterine growth rate ( 鈮，

本文編號(hào)：1861170