本文選題：腸道病毒71型 + 肉堿棕櫚酰基轉移酶II　； 參考：《青島大學》2016年博士論文

【摘要】：第一部分CPT II F352C突變對重癥EV71感染的臨床研究目的研究肉堿棕櫚酰基轉移酶II(CPT II)基因多態(tài)性與EV71感染遺傳易感性的關系,探討CPT II F352C突變及低血ATP水平對重癥EV71感染的影響。方法于2009年05月至2013年11月收集山東青島地區(qū)的EV71感染患兒333例,根據(jù)病情輕重分成EV71感染組、EV71腦炎組。提取患兒外周血白細胞的基因組DNA,應用聚合酶鏈反應擴增EV71感染患兒及328例正常對照兒童CPT II的5個外顯子,并利用haploview軟件識別該基因的所有單倍型,分析各個位點間的連鎖不平衡關系;同時檢測患者外周血ATP水平,記錄患兒的癥狀、體征、臨床特點及實驗室檢測指標。結果EV71感染組患兒CPT II F352C位點G等位基因頻率明顯高于正常對照組(26.9%VS20.4%,OR=1.432,95%CI=1.109-1.713,p=0.006),且該位點G等位基因頻率在EV71腦炎組與普通手足口病組相比,其差異也有明顯的統(tǒng)計學意義(36.3%VS24.7%,OR=1.734,95%CI=1.145-2.626,P=0.009)。V368I位點基因頻率、等位基因分布在EV71感染組與對照組中無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),但在EV71感染患兒中,EV71腦炎患兒V368I位點A等位基因頻率明顯高于普通手足口病患兒(17.7%VS27.7%,OR=0.564,95%CI=0.343-0.927,P=0.023)。CPT II F352C位點(TG+GG)基因型攜帶患兒ATP水平在重癥組(0.63±0.06 mmol/L vs.0.69±0.08 mmol/L,P0.01)和輕癥組(0.93±0.08 mmol/L vs.0.96±0.05mmol/L,P=0.025)中均有明顯下降,而且在EV71腦炎患兒中,A-G單倍型攜帶患兒其ATP水平較A-T單倍型(0.65±0.09mmol/L vs.0.69±0.07 mmol/L,P0.01)及G-T單倍型(0.65±0.09 mmol/L vs.0.69±0.05 mmol/L,P0.01)均有明顯下降;A-G單體型患兒ATP水平與持續(xù)發(fā)熱時間、CRP水平、白細胞計數(shù)及血糖濃度均呈顯著的負相關(P0.01,P0.01,P0.05,P0.01),而與病毒載量沒有明顯的相關關系(P0.05)。結論1.CPT II F352C突變與重癥EV71感染有關,G等位基因攜帶者EV71腦炎的發(fā)病幾率明顯升高。2.CPT II A-G單倍型攜帶者與重癥EV71感染有關。3.CPT II F352C位點G等位基因攜帶者EV71感染后ATP產(chǎn)生減少,導致了線粒體能量代謝障礙,從而介導EV71感染重癥的發(fā)生發(fā)展。第二部分CPTII F352C突變對CPTII蛋白功能的影響目的研究EV71感染及不同溫度干預轉染細胞后CPTⅡ酶活性、脂肪酸β-氧化和ATP水平、線粒體膜電位,最終明確1055TG/F352C突變對重癥EV71腦炎患者CPTⅡ功能的影響。方法隨機選取3例EV71重癥腦炎患兒:經(jīng)CPTⅡ基因全外顯子測序,證實為CPTⅡ1055/F352C位點野生型(TT)1例及CPTⅡ1055/F352C位點變異型2(TG/GG各1例)例。擴增制備含有CPTII F352C基因的片段,并與載體GV416進行重組,實現(xiàn)體外環(huán)化,獲得含有CPTII F352C野生型和突變型基因的過表達慢病毒載體并共同轉染Vero細胞,各組分為2部分,分別加入EV71懸液和等量DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)72小時后,分別置于37℃、39℃和41℃情況下培養(yǎng)2小時,并立即利用不同濃度的L-Carnitine作為底物,測定CPTⅡ剩余酶的活性;同時經(jīng)熒光探針JC-1染色,以流式細胞儀檢測數(shù)據(jù)經(jīng)Cell Quest軟件采集,以二通道(FL2)與一通道(FL1)平均熒光強度的比值(FL2/FLl)檢測線粒體膜電位;用1%的三氯乙酸處理Vero細胞后,收集上清液,經(jīng)luminometer檢測相對光單位,根據(jù)標準曲線計算ATP的濃度。結果CPTⅡ1055TG/F352C位點GT、GG基因型攜帶者未經(jīng)EV71干預時,于41℃培養(yǎng)2小時后,其線粒體膜電位較37℃、39℃條件下明顯下降;而感染EV71后,線粒體膜電位在各培養(yǎng)溫度下均有明顯下降,且與溫度呈明顯的負相關;同時GT、GG基因型Vero細胞經(jīng)EV71干預后,其ATP水平較前下降,且在39℃、41℃培養(yǎng)溫度下,其ATP水平較37℃培養(yǎng)條件下有顯著下降,與培養(yǎng)溫度之間存在明顯的負相關,TT基因型患者感染EV71后ATP水平無明顯差異;該位點G等位基因攜帶者感染EV71后CPTⅡ剩余酶活性較未干預時明顯降低,且隨溫度升高,呈熱不穩(wěn)定性,溫度越高,CPTⅡ剩余酶活性越低。結論1.CPT II F352C突變導致EV71感染后細胞線粒體膜電位下降,線粒體功能性損傷,繼而引起ATP產(chǎn)生不足。2.CPT II F352C突變體感染EV71后CPTⅡ酶活性下降,高熱加重CPT II功能缺陷,引起一系列代謝紊亂,影響ATP的產(chǎn)生。
[Abstract]:The results showed that the frequency of G allele of CPT II F352C was significantly higher in EV71 infection group than in the normal control group ( 26 . 9 % vs 20 . 4 % , OR = 1.432 , 95 % CI = 1.109 - 1.713 , p = 0.006 ) , and the frequency of G allele was significantly higher in EV71 infection group than in normal control group ( 36.3 % VS20.7 % , OR = 1.734 , 95 % CI = 1.145 - 2.626 , P = 0 . 009 ) . There was no significant difference between EV71 infection group and control group ( P0.05 ) . But in EV71 infected children , the allele frequency of V368I locus in EV71 encephalitis was significantly higher than that in children with common hand - foot disease ( 17.7 % VS21.7 % , OR = 0.564 , 95 % CI = 0.343 - 0.927 , P = 0.023 ) . The effect of the mutation of CPTII F352C on the function of CPTII protein was studied . The activity of the residual enzyme of CPT 鈪，

本文編號：1820469