本文選題：綠茶提取物（GTE） + 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）�。� 參考：《吉林大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的： 口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）位列惡性腫瘤的第6位，每年約有30萬新發(fā)病例，62%患者發(fā)生在發(fā)展中國家，5年生存率不足50%，嚴(yán)重危害人類的生命健康。目前OSCC的治療仍強調(diào)綜合治療模式，即以手術(shù)為主，輔以放化療。但是化療藥物不僅作用于腫瘤細(xì)胞，同時也作用于正常細(xì)胞，存在劑量限制性毒副作用，并且有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的可能。因此在天然藥物中篩選研發(fā)高效、低毒的抗腫瘤藥物是當(dāng)前研究熱點之一。綠茶是日常生活中頗受人們喜歡的飲料，近年研究發(fā)現(xiàn)綠茶提取物（green tea extract, GTE）具有較強的抗腫瘤活性，對皮膚癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌以及頭頸部腫瘤等多種腫瘤具有預(yù)防和治療作用，而綠茶對口腔鱗狀細(xì)胞的研究較少。本研究探討GTE及其主要成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate, EGCG）對3種人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響，并應(yīng)用蛋白通路陣列技術(shù)（protein pathway array）研究其對信號傳導(dǎo)通路的作用，同時應(yīng)用人口腔上皮癌移植瘤模型，探討GTE和EGCG對人口腔上皮癌小鼠皮下移植瘤的生長抑制作用。 方法： 共進(jìn)行3部分實驗。在第一部分實驗中，體外培養(yǎng)人CAL-27、SCC-25、KB細(xì)胞，應(yīng)用不同劑量的GTE和EGCG作用于三種細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測GTE和EGCG對細(xì)胞增殖的影響，篩選出敏感細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同劑量的GTE和EGCG對敏感細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，明確其抑制細(xì)胞增殖的機制。 在第二部分實驗中應(yīng)用蛋白通路陣列（protein pathway array）技術(shù)檢測GTE和EGCG對CAL-27、SCC-25、KB三種細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，并比較GTE和EGCG作用于不同細(xì)胞后蛋白表達(dá)的差異，明確其作用機制及所涉及的信號傳導(dǎo)通路。 第三部分實驗為體內(nèi)實驗，將對GTE和EGCG敏感的細(xì)胞接種于NCR/Nu裸小鼠右肩背部皮下，移植瘤長至4-6mm后隨機分為對照組、GTE組和EGCG組。GTE組：按50mg/kg灌胃，1次/日；EGCG組：按25mg/kg灌胃，1次/日；對照組：用等量生理鹽水灌胃，1次/日。連續(xù)給藥4周后，測量移植瘤體積及質(zhì)量，計算裸鼠腫瘤生長抑制率，體內(nèi)觀察GTE和EGCG對裸鼠皮下移植瘤生長的影響。 結(jié)果： 在第一部分實驗中研究發(fā)現(xiàn)，GTE和EGCG對3種類型的人口腔鱗癌細(xì)胞均有抑制作用，并呈濃度依賴性。不同的細(xì)胞對GTE和EGCG的敏感性不同，GTE和EGCG對CAL-27的抑制作用最強。三種鱗癌細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為：GTE為70、125和145μg/ml（對應(yīng)的EGCG濃度為35、62.5和72.5μg/ml），EGCG為59、102.5和102.5μg/ml，在EGCG濃度相同的情況下，GTE較EGCG對腫瘤細(xì)胞具有更強的抑制作用。不同濃度GTE（0、25、50和100μg/ml）、EGCG（0、12.5、25和50μg/ml）作用于CAL-27細(xì)胞，作用72h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期水平，發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞周期的影響主要是引起S期和G2/M期阻滯，G0/G1期細(xì)胞減少。 在第二部分實驗中應(yīng)用GTE（100μg/ml）、EGCG（50μg/ml）分別作用于CAL-27、SCC-25、KB三種鱗癌細(xì)胞，處理細(xì)胞48小時后，提取總蛋白，應(yīng)用蛋白通路陣列技術(shù)（protein pathway array）檢測信號傳到通路蛋白的表達(dá)。蛋白通路陣列技術(shù)共分析了107種與細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)的細(xì)胞通路蛋白，共發(fā)現(xiàn)46個蛋白在3種鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)，應(yīng)用ANOVA分析，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)處理的3種細(xì)胞中23個蛋白表達(dá)明顯異常。應(yīng)用BRB分析軟件顯示SCC-25與KB細(xì)胞蛋白表達(dá)具有相似性，，可能揭示CAL-27細(xì)胞對GTE和EGCG敏感的原因。經(jīng)GTE和EGCG處理48小時的CAL-27、SCC-25、KB細(xì)胞，經(jīng)ANOVA軟件分析共發(fā)現(xiàn)21個蛋白治療前后表達(dá)異常。僅CDK6在3種細(xì)胞中均表達(dá)下調(diào)。雖然GTE和EGCG處理細(xì)胞后蛋白表達(dá)在細(xì)胞之間存在差異，但GTE和EGCG均可導(dǎo)致與細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)。GTE和EGCG處理CAL-27細(xì)胞后p-PDK1、p-ERK、p-CDC2、CDK6、CDK4、CDK2、Cyclin E的表達(dá)下調(diào)；處理SCC-25細(xì)胞后p-PDK1、p-CDC2、CDK6、Cyclin E、cPKCα表達(dá)下調(diào)；處理KB細(xì)胞后CDK6和CDC2表達(dá)下調(diào)。經(jīng)Western Blot確認(rèn)了以下結(jié)果：在CAL-27細(xì)胞中GTE、EGCG對p-PDK1、CDK4和CDK6的表達(dá)抑制是呈劑量依賴性的。同時，GTE和EGCG也可導(dǎo)致一些與增殖相關(guān)的蛋白表達(dá)上調(diào)。GTE和EGCG處理CAL-27細(xì)胞后Notch4表達(dá)上調(diào)，處理SCC-25細(xì)胞后CDK2和CDC2表達(dá)上調(diào)，處理KB細(xì)胞后p-ERK、p-CDC2、CDK2、cPKCα、ERK1/2表達(dá)上調(diào)。GTE和EGCG處理細(xì)胞后，還可以觀察到一些腫瘤抑制基因的表達(dá)下調(diào)（如p53、RB、PTEN）。不同鱗癌細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路存在不均一性。GTE和EGCG作用于腫瘤細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的多條信號傳導(dǎo)通路而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用，其中EGFR通路是主要受影響的通路。GTE比綠茶中的單一成分（如EGCG）具有更好的抗腫瘤作用。 在第三部分實驗中應(yīng)用GTE和EGCG敏感細(xì)胞CAL-27皮下植入裸鼠，通過體內(nèi)實驗我們發(fā)現(xiàn)GTE和EGCG對移植瘤的生長均有顯著的抑制作用（P0.01），在具有相同含量EGCG的情況下，GTE對移植瘤生長的抑制作用較EGCG更為明顯。 結(jié)論： GTE和EGCG均能抑制人口腔鱗癌CAL-27、SCC-25和KB細(xì)胞生長。GTE和EGCG通過引起細(xì)胞周期G2/M期和S期阻滯來抑制口腔鱗癌細(xì)胞生長。3種鱗癌細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路存在不均一性，不同細(xì)胞對GTE和EGCG的反應(yīng)性存在差異，CAL-27細(xì)胞對GTE和EGCG的敏感性最高。3種人口腔鱗癌細(xì)胞用GTE和EGCG處理后，共有21種蛋白的表達(dá)水平發(fā)生改變，提示GTE和EGCG可以影響多種通路蛋白的表達(dá)，調(diào)控多條信號傳導(dǎo)通路。GTE和EGCG對鱗癌細(xì)胞的作用可能主要影響EGFR通路，從而抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。動物實驗表明GTE和EGCG能明顯抑制人類口腔上皮癌異種移植瘤的增長。體外及體內(nèi)實驗均證明，在EGCG含量相同的情況下，GTE比EGCG具有更強的抗腫瘤作用。
[Abstract]:Purpose :

Oral squamous cell carcinoma ( OSCC ) is the sixth largest malignant tumor in the oral squamous cell carcinoma ( OSCC ) , with about 300,000 new cases per year . The 5 - year survival rate is less than 50 % in developing countries .

Method :

Three experiments were carried out in vitro . In the first experiment , the cultured human CAL - 27 , SCC - 25 and KB cells were cultured in vitro . The effects of GTE and GTE on cell proliferation were detected by MTT assay . The effects of GTE and GTE on cell cycle of sensitive cells were detected by flow cytometry , and the mechanism of inhibiting cell proliferation was defined .

In the second experiment , protein pathway array was used to detect the effects of GTE and EGG on the expression of CAL - 27 , SCC - 25 , KB in three cell proteins , and the difference of protein expression between GTE and egcg was compared . The mechanism of action and the signal transduction pathways involved were defined .

In the third part , the cells were inoculated on the right shoulder of the NCR / Nu nude mice , and the transplanted tumors were randomly divided into control group , GTE group and GTE group after 4 - 6 mm . GTE group : 50 mg / kg , 1 time per day ;
egcg group : gavage at 25 mg / kg once per day ;
Control group : After 4 weeks of continuous administration , the volume and mass of transplanted tumor were measured and the growth inhibition rate of nude mice was calculated . The effects of GTE and GTE on the growth of subcutaneous transplanted tumor in nude mice were observed .

Results :

In the first experiment , the inhibitory effect of GTE and GTE on three types of human oral squamous carcinoma cells was studied . The inhibitory effect of GTE and GTE on the tumor cells was strongest . The concentrations of GTE ( 0 , 25 , 50 and 100.mu . g / ml ) , EGTE ( 0 , 12.5 , 25 and 50 渭g / ml ) were the most effective . The effect of GTE ( 0 , 25 , 50 and 50 渭g / ml ) on the cell cycle was mainly caused by the arrest of S phase and G2 / M phase , and the G0 / G1 phase cells decreased .

In the second experiment , GTE ( 100.mu . g / ml ) was used in the treatment of three kinds of squamous cell carcinoma cells ( CAL - 27 , SCC - 25 , KB ) .
After treatment of SCC - 25 cells , p - PDK1 , p - CDC2 , CDk6 , Cyclin E , cPKC偽 expression were downregulated .
The expressions of CDK2 , CDC2 , CDK2 , cPKC偽 , ERK 1 / 2 were up - regulated in CAL - 27 cells . After the treatment of KB cells , the expression of CDK2 and CDC2 was up - regulated . After treatment of KB cells , the expression of p - ERK , p - CDC2 , CDK2 , cPKC偽 and / 2 / 2 was up - regulated . After the treatment of cells with GTE and egcg , it was also observed that some tumor suppressor genes were downregulated ( e.g . p53 , RB , PTEN ) . GTE plays an important role in inhibiting tumor growth . GTE plays an important role in inhibiting tumor growth . GTE plays an important role in tumor growth . GTE has a better antitumor effect than a single component of green tea , such as egcg .

In the third experiment , GTE and GTE - sensitive cells CAL - 27 were implanted subcutaneously in nude mice . Through in vivo experiments , we found that GTE and egcg had a significant inhibitory effect on the growth of transplanted tumors ( P0.01 ) .

Conclusion :

GTE and egcg inhibited the growth of human oral squamous cell carcinoma ( SCC - 27 ) , SCC - 25 ( SCC - 25 ) and KB cells .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳向華;陸云飛;;MAPK信號傳導(dǎo)通路與乳腺癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2010年04期

本文編號：1805065