本文選題：肺炎支原體 + real-time��； 參考：《浙江大學》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的：近年來隨著肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, MP)基因組學研究的發(fā)展,關(guān)于MP基因型與MP菌株變異、病情進展、耐藥及治療等方面的關(guān)系受到了越來越多的關(guān)注。在分子水平上對MP菌株進行分型可以較好地進行流行病學監(jiān)測并研究疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。目前國內(nèi)外對MP菌株的傳統(tǒng)分型方法受限于MP基因序列保守性,只有包含少量的點突變的開放閱讀框架(Open reading frame, ORF)及MP管家基因、結(jié)構(gòu)基因較難發(fā)現(xiàn)多態(tài)性,故對MP區(qū)分度較低。多位點可變重復序列分析(Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis, MLVA)是近年來發(fā)展起來的一種以PCR為基礎(chǔ),根據(jù)所檢測的菌株基因序列中不同位點的、可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(Variable-number tandem repeats, VNTR)的重復單元拷貝數(shù)的差異來進行分子分型的技術(shù)。該分型方法可以將菌株分型變得更為細化,有利于臨床診斷、治療及流行病學的監(jiān)測。為建立MLVA分型體系并探討其臨床意義,本文采用MP感染兒童的口咽拭子(Oropharyngeal swabs, OP)進行體外分離培養(yǎng),將所獲取的臨床菌株采用雙探針熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)、基于P1黏附蛋白基因限制性酶切圖譜(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)及MLVA進行基因分型,旨在探討MP菌株不同MLVA亞型的流行狀況以及MLVA亞型與臨床的關(guān)系,闡明MP分子流行病學現(xiàn)狀,為臨床診斷及治療提供幫助。方法：(1) MLVA分型體系的建立：采用標準株及臨床樣本結(jié)合方法研究MP體外培養(yǎng)分離純化的最佳條件。使用標準菌株MP-M129和MP-FH研究real-time PCR及MLVA分型最佳反應(yīng)條件。(2) MLVA分型臨床應(yīng)用：以2014年3月-2015年4月浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院發(fā)熱門診及住院患兒1131例和兩所正在流行MP感染小學的122名兒童的OP標本進行雙探針real-time PCR確定MP陽性,篩選后在自制MP瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)、分離、純化及保存,所取得菌株再進行MLVA進行基因分型及Pl-RFLP對比。采集臨床資料統(tǒng)計分析MP的發(fā)熱率、平均發(fā)熱天數(shù)、最高體溫、激素使用率及病情輕重程度等指標是否與MLVA基因型有關(guān)。結(jié)果：(1)雙探針Real-time PCR及臨床所應(yīng)用的MP商用檢測試劑盒共檢出217例臨床MP陽性樣本,以MP商用檢測試劑盒為參照,雙探針Real-time PCR法敏感性為92.3%、特異性91.7%；(2)MP體外培養(yǎng)、分離及純化得到MP菌株共164株,以雙探針Real-timePCR陽性為參照,分離率為66.67%(164/246)。其中來自門診或住院為146株,來自MP暴發(fā)流行兩所小學的有18株；(3)146份門診或住院MP樣本進行了MLVA分型,結(jié)果為MLVA A型(13例)、MLVA B型(1例)、MLVA E型(36例)、MLVA H型(1例)、MLVA J型(27例)、MLVA S型(1例)、MLVA P型(39例)、MLVA U型(20例)、MLVAX型(6例)。18份小學流行MP樣本分型結(jié)果為MLVA J型(5例)與U型(13例),且同一所小學所流行的MP菌株為同一型。(4) MLVA亞型的臨床資料比較分析發(fā)現(xiàn),U型引起MP重癥感染比率較其它各型高。結(jié)論：(1) 本研究所開發(fā)的雙探針real-time PCR體系具有較高的敏感性和特異性,可用于臨床檢測；(2) 成功建立了MP體外分離培養(yǎng)體系,分離率66.67%,與國外實驗室水平相仿；(3) U型MP易引起MP重癥感染。
[Abstract]:In recent years , with the development of mycoplasmal pneumonia ( MP ) gene group , the relationship between MP genotype and MP strain variation , disease progression , drug resistance and treatment have been paid more and more attention . ( 2 ) Clinical application of MLVA typing : A double - probe real - time PCR was used to determine MP positive by double - probe real - time PCR . The results were as follows : ( 1 ) The sensitivity of double - probe Real - time PCR and clinical application of MP was 92.3 % and 91.7 % , respectively .
( 2 ) In vitro culture , isolation and purification of MP strains , 164 strains of MP were isolated and purified by double - probe Real - time PCR , with a separation rate of 66.67 % ( 164 / 246 ) . Among them , 146 were from outpatient or inpatient , 18 from MP outbreak and two primary schools ;
( 3 ) MLVA typing was performed in 146 outpatient or hospitalized MP samples , the results were MLVA type A ( 13 cases ) , MLVA type B ( 1 case ) , MLVA type E ( n = 36 ) , MLVA type H ( n = 39 ) , MLVA J type ( 20 cases ) , MLVA type ( 6 cases ) , MLVA P type ( 39 cases ) , MLVA U type ( 20 cases ) , MLVA type ( 6 cases ) .
( 2 ) The isolation and culture system of MP in vitro was successfully established , the separation rate was 66.67 % , which was similar to the foreign laboratory level ;
and ( 3 ) the U - type MP is easy to cause MP severe infection .

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R725.6

【參考文獻】

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本文編號：1792470