本文選題：脆性X綜合癥 + mGluR1受體��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：【目的】 探索FMR1KO小鼠突觸可塑性調(diào)節(jié)異常的機(jī)制以及如何恢復(fù)ACC區(qū)的可塑性，以期對進(jìn)一步認(rèn)識脆性X綜合癥的病理機(jī)制，發(fā)掘潛在的藥物治療新靶點(diǎn)。 【方法】 1全細(xì)胞膜片鉗記錄 小鼠采用1-2%異氟醚麻醉，取腦。振動切片機(jī)橫向切取300μmACC腦片，室溫下置于混合氣飽和的人工腦脊液(ACSF)中，恢復(fù)1小時后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在具有紅外線DIC系統(tǒng)的顯微鏡下觀察ACC第II/III層錐體神經(jīng)元。ACSF灌流液中加入100M picrotoxin，刺激電極放置于ACC第V層，記錄電極放置于ACC第II/III層，在錐體神經(jīng)元中選取狀態(tài)良好的椎體神經(jīng)元進(jìn)行封接。記錄興奮性突觸后電流（EPSC）和LTP。LTP誘導(dǎo)方法：80次刺激，頻率2Hz，同時神經(jīng)元鉗制于+30mV，然后恢復(fù)到基線記錄模式，鉗制電壓恢復(fù)在-70mV。記錄mEPSC時，灌流液中加入TTX，轉(zhuǎn)換為Gap free記錄模式。 2小鼠前額葉皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 取孕18天胎鼠，在無菌條件下斷頭取腦置于盛有PBS液的平皿中剝?nèi)ツX膜，取大腦皮層并剪碎，消化后反復(fù)吹打制備細(xì)胞懸液。接種于涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)第三天加入阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的繼續(xù)增長。SKF81297（5μM），DL-AP3（10μM)），和forskolin（5μM）在收集細(xì)胞前24小時分組加入培養(yǎng)基，收集細(xì)胞待用。 3Western blot檢測 采用常規(guī)腦組織樣本制備方法制備ACC區(qū)組織樣品。培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞膜蛋白的提取，采用細(xì)胞膜蛋白生物素試劑盒提取的方法，提取過程同過往文獻(xiàn)報(bào)道[1]。Western blot檢測方法：將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上后，分別用mGluR5，GluR1，NR2A，NR2B，p-NR2B的一抗封閉各自分子量相應(yīng)的條帶，孵育后，漂洗，加入二抗漂洗發(fā)光。曝光完成后，經(jīng)顯影和定影，自來水沖洗，最后在室溫下晾干。用β-actin或cadherin作為標(biāo)準(zhǔn)定量分子，確定各個蛋白相對量的多少。 4行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 開場實(shí)驗(yàn)裝置由曠場反應(yīng)箱和數(shù)據(jù)自動采集和處理系統(tǒng)兩部分組成，實(shí)驗(yàn)小鼠置于曠場的中央，記錄并分析它的運(yùn)動情況。高架十字迷宮各有兩個對稱的開放臂和封閉臂，十字中間為正方形平臺。實(shí)驗(yàn)小鼠逐個放于中央平臺后，記錄每個小鼠5min內(nèi)進(jìn)入開放臂或封閉臂的次數(shù)與時間，并計(jì)算進(jìn)入兩臂的總次數(shù)。Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)歷時數(shù)天,每天將大鼠面向池壁分別從4個入水點(diǎn)放入水中若干次,記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間。動物實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)前分別腹腔注射生理鹽水，DL-AP3和/或SKF81297，45分鐘后開始實(shí)驗(yàn)。 【結(jié)果】 1SKF81297和DL-AP3對FMR1基因敲除小鼠LTP的增強(qiáng) 我們用全細(xì)胞膜片鉗的方法對成年腦薄片的前扣帶回區(qū)II III層錐體細(xì)胞的電生理活動進(jìn)行記錄，采用突觸前電刺激誘導(dǎo)突觸后去極化的方法使神經(jīng)元產(chǎn)生LTP并記錄。我們發(fā)現(xiàn)在FMR1WT小鼠，該腦區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生了明顯的長時程增強(qiáng)現(xiàn)象。但在FMR1KO小鼠，這種增強(qiáng)效應(yīng)不明顯。我們發(fā)現(xiàn)，正常和敲除小鼠的LTP效應(yīng)與各自的空白對照組相比沒有顯著性差異。接下來，我們檢測了D1受體激動劑應(yīng)用組的LTP誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)在D1受體激動劑SKF812975μM孵育十分鐘后，正常小鼠腦薄片誘導(dǎo)后的LTP效應(yīng)明顯增強(qiáng),說明激活D1受體能增強(qiáng)正常小鼠的LTP效應(yīng)。而在FMR1KO小鼠，應(yīng)用SKF81297沒有增強(qiáng)其誘導(dǎo)后的LTP效應(yīng)，說明D1受體激動劑的LTP增強(qiáng)作用在FMR1基因敲除小鼠ACC區(qū)是受損的。 我們在檢測同時使用D1受體激動劑和mGluR1受體拮抗劑對LTP誘導(dǎo)的影響時，發(fā)現(xiàn)SKF81297和DL-AP3共同孵育腦片十分鐘，能顯著增強(qiáng)正常小鼠的LTP效應(yīng)，這種增強(qiáng)效應(yīng)與單獨(dú)應(yīng)用D1受體激動劑SKF81297的正常小鼠相比沒有顯著性差異。在FMR1基因敲除小鼠，同時使用D1受體激動劑和mGluR1受體拮抗劑，ACC區(qū)LTP效應(yīng)與單獨(dú)使用D1受體激動劑有顯著性增強(qiáng)。 為了檢測合用SKF81297和DL-AP3對FMR1KO小鼠LTP的增強(qiáng)效應(yīng)是否來源于D1受體激動劑，我們在孵育的液體中同時加入D1受體抑制劑，發(fā)現(xiàn)這種LTP增強(qiáng)效應(yīng)消失�？梢哉J(rèn)為FMR1KO小鼠LTP的增強(qiáng)效應(yīng)來源于D1受體激動劑，這種效應(yīng)是由mGluR1受體拮抗劑恢復(fù)的。 2腺苷酸環(huán)化酶激動劑恢復(fù)D1受體激動劑對FMR1KO小鼠ACC區(qū)LTP增強(qiáng)效應(yīng) 為了確定增加腺苷酸環(huán)化酶的量是否能替代D1受體的作用，我們研究了腺苷酸環(huán)化酶激動劑forskolin對FMR1KO小鼠ACC區(qū)LTP是否有增強(qiáng)作用。發(fā)現(xiàn)加入forskolin且有電刺激誘導(dǎo)的情況下，LTP的幅度與未使用forskolin的FMR1WT小鼠對照組相比無顯著性差異。與單獨(dú)使用forskolin的FMR1WT小鼠組相比，DL-AP3與forskolin結(jié)合使用并沒有引起FMR1WT小鼠LTP幅度增加。單獨(dú)使用Forskolin并電刺激誘導(dǎo)LTP的FMR1KO未產(chǎn)生明顯的LTP增強(qiáng)效應(yīng)，而聯(lián)合使用forskolin和DL-AP3的FMR1KO小鼠LTP有增強(qiáng)。 為了確定多巴胺能介導(dǎo)的LTP效應(yīng)是否需要NMDA受體的激活，我們在灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP5，發(fā)現(xiàn)SKF81297介導(dǎo)的LTP增強(qiáng)效應(yīng)消失。同樣，LTP增強(qiáng)效應(yīng)在灌流液中加入10mM BAPTA后也被阻斷，表明多巴胺能介導(dǎo)的LTP效應(yīng)需要NMDA受體的激活和突觸后鈣離子濃度增加的。 3mGluR1受體介導(dǎo)的可塑性是經(jīng)由突觸后機(jī)制產(chǎn)生的 我們檢測了ACC區(qū)的雙脈沖易化(PPF)情況。在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)，灌流液中同時或分別加入DL-AP3和SKF81297前后，PPF的五個脈沖間隔產(chǎn)生的突觸后反應(yīng)沒有顯著性差異。結(jié)果表明，突觸前遞質(zhì)釋放沒有改變，mGluR1受體介導(dǎo)的可塑性很可能是經(jīng)由突觸后機(jī)制產(chǎn)生的。 4mGluR1受體拮抗劑不影響突觸的基礎(chǔ)谷氨酸能遞質(zhì)釋放 我們檢測了ACC區(qū)AMPA受體介導(dǎo)的微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)。在灌流液中同時或分別加入DL-AP3和SKF81297，AMPA受體介導(dǎo)的微小興奮性突觸后電流在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)都沒有發(fā)生顯著性變化。表明mGluR1受體拮抗劑不影響突觸的基礎(chǔ)性谷氨酸能遞質(zhì)釋放。 5AMPA受體的表達(dá) 為了確定這種協(xié)同作用對AMPA受體的表達(dá)和上膜有何影響，，我們在培養(yǎng)的PFC細(xì)胞中加入D1受體激動劑SKF81297和mGluR1受體拮抗劑DL-AP3。發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用SKF81297或者聯(lián)合使用DL-AP3都會增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元總的GluR1的表達(dá)。而在FMR1KO小鼠，單獨(dú)使用SKF81297或者DL-AP3都沒有改變培養(yǎng)神經(jīng)元總的GluR1的表達(dá)。單獨(dú)使用SKF81297或者聯(lián)合使用DL-AP3都會增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元AMPA受體在膜上的表達(dá)。SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3增加了培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元GluR1在膜上的表達(dá)。表明mGluR1受體恢復(fù)了D1受體激動劑對FMR1KO小鼠PFC細(xì)胞AMPA GluR1受體在膜上表達(dá)的增強(qiáng)作用。 我們檢測了DL-AP3和forskolin對培養(yǎng)神經(jīng)元GluR1向膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程的影響。發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用Forskolin或聯(lián)合使用DL-AP3都會增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元總的GluR1的表達(dá)。單獨(dú)使用Forskolin或聯(lián)合使用DL-AP3都沒有增加培養(yǎng)的FMR1KO小鼠PFC神經(jīng)元總的GluR1的表達(dá)。而單獨(dú)使用Forskolin或聯(lián)合使用DL-AP3都會增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元GluR1在膜上的表達(dá)。forskolin聯(lián)合使用DL-AP3增加了培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元GluR1受體在膜上的表達(dá)。表明D1受體激動劑SKF81297和mGluR1受體拮抗劑DL-AP3在FMR1KO小鼠上的聯(lián)合作用是通過抑制mGluR1受體，激活腺苷酸環(huán)化酶實(shí)現(xiàn)的。 6mGluR5，D1受體和NMDA受體亞型在PFC培養(yǎng)神經(jīng)元上的表達(dá) 通過Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)mGluR5和D1受體以及NMDA受體的兩個亞型NR2A和NR2B受體在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)的表達(dá)水平都沒有顯著性差異。因此，mGluR5和D1受體在ACC區(qū)突觸增強(qiáng)作用受損不是因?yàn)閙GluR5和D1受體以及NR2A和NR2B受體的基礎(chǔ)表達(dá)水平差異引起的。且單獨(dú)使用SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3都不影響NR2A和NR2B亞型在FMR1WT和KO小鼠PFC神經(jīng)元上的表達(dá)。然而，單獨(dú)使用SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3都顯著性增加了NR2B亞型磷酸化位點(diǎn)Tyr-1472(p-NR2B-Tyr1472)在FMR1WT小鼠PFC培養(yǎng)神經(jīng)元上的表達(dá)。同時，單獨(dú)使用SKF81297沒有增加NR2B亞型磷酸化位點(diǎn)Tyr-1472(p-NR2B-Tyr1472)在FMR1KO小鼠PFC培養(yǎng)神經(jīng)元上的表達(dá)。而SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3能恢復(fù)SKF81297在FMR1KO小鼠PFC培養(yǎng)神經(jīng)元上p-NR2B-Tyr1472的表達(dá)增加作用。 7SKF81297與DL-AP3聯(lián)合效應(yīng)對FMR1KO小鼠行為學(xué)的影響 通過行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1KO小鼠的自發(fā)活動能力增加。腹腔注射SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP345分鐘后，F(xiàn)MR1WT小鼠的自發(fā)活動的運(yùn)動距離都沒有顯著性改變。然而，單獨(dú)腹腔注射SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP345分鐘后，F(xiàn)MR1KO小鼠自發(fā)活動的運(yùn)動距離都有顯著性降低。在模擬焦慮行為的高架十字實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1KO與WT組小鼠以及單獨(dú)應(yīng)用SKF81297或聯(lián)合使用DL-AP3組之間焦慮指標(biāo)沒有顯著性差異，表明脆性X綜合癥模型小鼠沒有表現(xiàn)出焦慮樣行為，且焦慮樣行為很可能不是通過D1受體通路起作用的。. 小鼠每天單獨(dú)腹腔注射SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP35周后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。對此后4天FMR1KO和WT小鼠找到平臺所用時間分析發(fā)現(xiàn)，在第一天兩組之間就有顯著性差異，F(xiàn)MR1KO組比WT組小鼠找到平臺所用時間長。單獨(dú)使用SKF81297或DL-AP3均不影響FMR1KO和WT小鼠找到平臺所用時間，聯(lián)合使用SKF81297和DL-AP3在前3天與同基因型組相比沒有顯著改變，而在第4天，F(xiàn)MR1KO小鼠與聯(lián)合用藥的FMR1KO小鼠組相比有顯著性差異，聯(lián)合使用SKF81297和DL-AP3在第四天顯著降低FMR1KO小鼠找到平臺所用時間。FMR1KO和WT小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)過程中的平均游泳速度在組間沒有顯著性差異。 8FMR1KO小鼠ACC區(qū)五羥色胺能突觸可塑性異常 為了明確FMR1KO小鼠ACC區(qū)除多巴胺系統(tǒng)外，其他有關(guān)突觸可塑性的遞質(zhì)系統(tǒng)是否正常，我們檢測了5-HT2A系統(tǒng)在ACC區(qū)有關(guān)突觸可塑性的電生理學(xué)和分子生物學(xué)表現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)使用5-HT2A受體拮抗劑的WT小鼠能增強(qiáng)LTP效應(yīng)。然而，5-HT2A受體拮抗劑在FMR1KO沒有表現(xiàn)出對LTP的增強(qiáng)效應(yīng)。電生理實(shí)驗(yàn)表明，與多巴胺系統(tǒng)在FMR1KO小鼠ACC區(qū)突觸可塑性功能受損類似，五羥色胺能系統(tǒng)在FMR1KO小鼠ACC區(qū)調(diào)節(jié)突觸可塑性的功能也是受損的。.我們在灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP5(50μM)，發(fā)現(xiàn)R-96544(5μM)介導(dǎo)的在FMR1WT小鼠LTP增強(qiáng)效應(yīng)消失。通過雙脈沖易化(PPF)表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在FMR1WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)，在灌流液中加入R-96544(5μM)前后，PPF的五個脈沖間隔產(chǎn)生的突觸后反應(yīng)沒有顯著性差異。結(jié)果表明，突觸前遞質(zhì)釋放沒有改變，R-96544介導(dǎo)的可塑性很可能是經(jīng)由突觸后機(jī)制產(chǎn)生的。為進(jìn)一步明確FMR1KO小鼠五羥色胺能受體調(diào)節(jié)LTP功能受損的機(jī)制，我們檢測了5-HT2A受體在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)5-HT2A受體以及NMDA受體的兩個亞型NR2A和NR2B受體在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)的表達(dá)水平都沒有顯著性差異。5-HT2A受體在ACC區(qū)突觸增強(qiáng)作用受損不是因?yàn)?-HT2A受體以及NR2A和NR2B受體的基礎(chǔ)表達(dá)水平差異引起的。 我們在培養(yǎng)的PFC細(xì)胞中加入5-HT2A受體拮抗劑R-96544，發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液中有1μM五羥色胺的情況下，使用R-96544(5μM)會增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經(jīng)元膜上GluR1的表達(dá)。表明5-HT2A受體拮抗劑能增強(qiáng)FMR1WT小鼠PFC細(xì)胞GluR1受體在膜上表達(dá)，而這種增強(qiáng)作用在FMR1KO小鼠消失，表明FMRP在五羥色胺調(diào)控GluR1受體在膜上表達(dá)的過程中起著重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R749.94

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1737184