本文選題：β地中海貧血　切入點：黃芪　出處：《南方醫(yī)科大學》2012年博士論文

【摘要】：研究背景：我國尤其南方各省是p地中海貧血的高發(fā)區(qū)。p地貧患兒由于p珠蛋白鏈的合成障礙及α、p鏈的不平衡導致無效造血、慢性溶血性貧血及多種并發(fā)癥。重型及部分中間型患兒常常需要依賴終身規(guī)律的輸血,同時也需要長期的鐵螯合治療以減輕機體鐵負荷。輸血及鐵螯合劑對于我國等發(fā)展中國家的患者均是沉重的經濟負擔,同時也存在輸血相關性傳染病、血管內皮損傷、骨關節(jié)痛等諸多副作用。地貧的基因治療目前離臨床應用還有很長一段距離,而干細胞移植由于干細胞來源、移植風險、費用等因素也很難普及。目前我國很多β地貧患兒均沒有得到規(guī)律的治療而長期處于低血紅蛋白的狀態(tài)從而嚴重影響到生長發(fā)育甚至危及到生命。對大量地貧患兒如何進行有效而又副作用小的治療,是當今醫(yī)學的難題,也是重要的社會問題。 藥物基因誘導是p地貧的研究熱點。其基本原理是通過藥物誘導新生兒期后近乎關閉的γ珠蛋白基因重新高表達,合成胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin,HbF)以在功能上替代正常的血紅蛋白,同時也可結合過剩的α鏈以減輕紅細胞破壞,從而改善貧血及減少并發(fā)癥。Y珠蛋白基因誘導藥物主要包括細胞毒藥物、DNA甲基轉移酶抑制劑、組蛋白脫乙�；敢种苿�、雷帕霉素靶點抑制劑、細胞因子等種類。但目前可真正應用于臨床的藥物還很少,而各種基因誘導的化學藥物無論是羥基脲、5-氮胞苷、丁酸鹽還是促紅細胞生成素等均有各自明顯的缺點,或是有骨髓抑制、潛在致癌等副作用,或是藥效短暫,或是價格昂貴等,均嚴重限制了其臨床應用。 中醫(yī)藥相對副作用較小,目前以中藥治療p地貧的研究多數(shù)是個案報道及一般性臨床觀察,規(guī)范深入的課題僅見益髓生血顆粒系列研究。但益髓生血顆粒為大復方,藥味眾多,難以進一步研究及發(fā)現(xiàn)其有效成分,有必要從單味中藥或小復方發(fā)掘基因誘導藥物。本課題組既往及新近的體外實驗發(fā)現(xiàn)中藥龜板、黃芪、黨參等能使人類紅系K562細胞或p地貧患者紅系祖細胞的丫珠蛋白mRNA增加,HbF提升。與丁酸鹽比較中藥對細胞生長無抑制,誘導維持時間也顯著較長。對單味黃芪的深入研究發(fā)現(xiàn),其誘導HbF的主要有效成分在富含多糖的水溶部分,而黃芪多糖有類似作用�；隗w外實驗研究所顯示的效果,結合中醫(yī)中藥理論,本研究首次選用單味黃芪以及由黃芪、黨參、龜板組成的小復方中藥對p地貧患兒開展隨機對照雙盲的前瞻性臨床研究,以在體內驗證中藥的效果,客觀評價其臨床療效及安全性。 本研究同時擬對中藥在患者體內起效的分子機制進行探討,驗證本課題的中藥在體內是否也能誘導γ珠蛋白基因的表達。p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)是與γ珠蛋白的生成關系最為密切的信號分子之一。本課題組既往的研究表明,p38MAPK信號通路的激活是丁酸鈉等藥物誘導紅系細胞γ珠蛋白基因表達的重要機制,涉及對轉錄因子的影響及表觀遺傳機制。本課題組其它博士生新近的研究也表明,龜板、黃芪在體外誘導γ基因也與p38MAPK的磷酸化有關。因而本研究也對患兒用藥后體內p38MAPK的變化進行探討,以從細胞信號通路角度分析中藥的體內起效機制。 方法：1.患者分組與治療方案：本課題為隨機對照雙盲的前瞻性臨床試驗。兩家研究中心共有57例β地中海貧血患兒納入研究,按中間型及重型隨機分配進入復方組、黃芪組、安慰劑對照組。復方組患兒口服黃芪、黨參及龜板顆粒,其中2-6歲患兒每日三種中藥顆粒各1袋,6-12歲患兒每日各2袋,12-18歲患兒每日各3袋。黃芪組口服單味黃芪顆粒,其中2-6歲患兒每日3袋,6～12歲患兒每日6袋,12～18歲患兒每日9袋。對照組口服安慰劑顆粒,其中2-6歲患兒每日3袋,6-12歲患兒每日6袋,12～18歲患兒每日9袋。療程均為12周。重型患兒在以上治療基礎上加用輸血治療,每隔4周輸血一次。 2.評價療效的指標：(1)治療開始前及治療滿4周、8周、12周分別取患兒的手指末梢血檢測血常規(guī),觀察血紅蛋白(hemoglobin, Hb)、紅細胞總數(shù)(redblood cell, RBC)、平均紅細胞體積(mean corpuscular volume, MC V)、平均紅細胞血紅蛋白量(1mean corpuscular hemoglobin, MCH)、紅細胞體積分布寬度(redblood cell volume distribution width, RDW)、(2)治療開始前及治療滿12周后分別抽取患兒靜脈血以堿性血紅蛋白電泳檢測HbF比例；采用堿性血紅蛋白電泳結合比色法檢測HbF含量。(3)治療開始前及治療滿12周后分別抽取患兒靜脈血計數(shù)外周血網(wǎng)織紅細胞；采用比色法檢測紅細胞孵育滲透脆性。(4)對中間型患兒在治療開始前及治療滿12周后腹部觸診檢查肝肋下及脾肋下的大小。(5)在治療開始前及治療滿4周、8周、12周分別測量體重、心率及血壓一次。(6)參照中醫(yī)證候分型標準,統(tǒng)計各組患兒氣血兩虛與肝腎虧虛四診癥狀的改善率。 3.療效標準：(1)顯效：治療后Hb上升≥3g/dL,同時伴有不同程度的HbF升高；(2)有效：治療后Hb上升≥0.5g/dL但3g/dL,同時伴有不同程度的HbF升高；(3)無效：治療后Hb上升0.5g/dL。療程結束后統(tǒng)計各組的顯效、有效及無效人數(shù),計算顯效率及總有效率。 4.安全性指標：如前述檢測血常規(guī),觀察白細胞總數(shù)(White blood cell, WBC)、中性粒細胞總數(shù)(neutrophil, NEU)、血小板總數(shù)(platelet, PLT)。治療開始前及治療滿12周分別檢測肝腎功能指標,包括血清丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、谷氨酸�；D移酶、尿素氮、肌酐。療程結束后統(tǒng)計各組患兒各項不良反應癥狀發(fā)生率及各項評價安全性的實驗室指標。 5.分子生物學實驗：課題同時以實時熒光定量RT-PCR、Western Blot方法研究患兒治療前后α,β,Gγ和Aγ珠蛋白基因的表達水平以及p38MAPK細胞信號通路的激活。在治療前及治療滿12周后,抽取中間型各組患兒外周血,采用不連續(xù)密度梯度離心法分離包含有核紅細胞在內的單個核細胞。從Genbank查得各基因序列,設計并合成引物。用Trizol提取總RNA后進行逆轉錄反應,隨后進行實時熒光定量PCR反應。根據(jù)標準曲線、各樣本的Ct值并以內參照基因矯正得出各目的基因mRNA水平相對的拷貝數(shù)。另外提取蛋白,SDS-PAGE分離蛋白,蛋白質轉膜,用p38MAPK和磷酸化p38MAPK抗體與蛋白質雜交,通過圖像分析系統(tǒng)分析每個樣p38MAPK磷酸化p38MAPK條帶與內參照條帶的積分光密度值比值。 6.統(tǒng)計學分析：以原始數(shù)據(jù)錄入SPSS13.0軟件建立數(shù)據(jù)庫并進行統(tǒng)計學處理,對各指標進行組間比較及治療前后比較.o P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果：1.血常規(guī)指標：經黃芪及其復方中藥顆粒12周的治療,中間型p地貧患兒的Hb水平有顯著提升,其中復方組Hb提升值為1.21±1.12g/dL,黃芪組為1.05±0.80g/dL,而安慰劑對照組則輕微下降了0.28±0.51g/dL,3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=10.209, P0.001)。中間型復方組12周的Hb水平為8.91±1.07g/dL,黃芪組Hb水平為8.40±1.06g/dL,均顯著高于對照組的7.30±1.07g/dL(分別P=0.001,P=0.017)。中間型復方組Hb在治療前后不同時間水平間的差異具有顯著性(F=8.773,P0.001),黃芪組Hb前后差異也具有顯著性(F=20.940, P0.001),而對照組Hb在治療前后則無顯著性差異(P0.05)。12周的治療后,重型地貧患兒復方組Hb提升值為0.46±0.61g/dL,顯著高于對照組的-0.55±0.66g/dL(P=0.033)。重型復方組12周的Hb水平為7.91±0.49/dL黃芪組Hb水平為7.74±1.15g/dL,均顯著高于對照組的6.65±1.10g/dL(分別P=0.024,P=0.043)。中藥治療也能在一定程度上改善患兒的其他血常規(guī)指標包括RBC及MCH。 2.HbF水平：中間型復方組治療后HbF比例較治療前有顯著提升(62.80%±22,85%vs.54.00%±20.63%,t=-2.910,P=0.016):黃芪組治療后HbF比例也較治療前顯著提升(68.10%±16.63%vs.60.06%±16.29%,t=-4.103,P=0.001)。兩組HbF含量在治療后較治療前也有顯著增加(分別t=-3.896,P=0.003；t=-4.616,P=0.001)。中間型復方組、黃芪組治療后HbF含量均顯著高于對照組(分別P=0.001,P0.001)。重型復方組治療后HbF比例較治療前也有顯著提升(22.75±6.97%vs.20.23±7.06%,t=-3.424,P=0.014):黃芪組治療后HbF比例同樣比治療前顯著提升(29.01±12.50%vs.22.46±12.25%,t=-3.215,P=0.015)。兩組HbF含量也有顯著性增加(分別t=-3.156,P=0.020；t=-3.491,P=0.010)。無論在中間型患兒還是重型患兒中,安慰劑對照組的HbF比例及含量在治療前后的差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。以上結果提示黃芪及其復方均能顯著提升患兒的HbF水平。 3.其他臨床研究指標：中間型黃芪組、重型復方組治療后的網(wǎng)織紅細胞比治療前均有顯著性升高(分別t=-5.790,P0.001；t=-3.195,P=0.019),中間型復方組治療后的紅細胞孵育滲透脆性也較治療前有顯著性改善(t=-2.331,P=0.042)。各組肝脾肋下大小在治療前后無顯著性差異。中間型黃芪組的體重、重型復方組的收縮壓治療后比治療前均有顯著性提升(分別F=5.330,P=0.017；F=8.551,P=0.001)。另外中藥治療對中醫(yī)氣血兩虛癥狀及肝腎虧虛癥狀的改善均優(yōu)于安慰劑。 4.臨床療效判定：中間型復方組患兒的總有效率為63.6%,黃芪組患兒的總有效率為61.5%,而對照組為9.1%,三者有顯著性差異(x2=8.681,P=0.013)。重型復方組患兒的總有效率為42.9%,黃芪組患兒的總有效率為50.0%,而對照組為0%,三者也有顯著性差異(x2=6.871,P=0.032)。綜合以上結果,提示黃芪及其復方中藥治療小兒β地貧是具有一定療效的,可基本排除安慰劑效應。 5.不同藥物及不同類型患兒的療效：對于以上大多數(shù)指標,復方組及黃芪組的差異無統(tǒng)計學意義,提示兩種藥物的療效接近。中間型患兒的總有效率雖高于重型患兒,但按目前的樣本量未發(fā)現(xiàn)兩者有顯著性差異。中藥對不同表型、不同基因型、不同中醫(yī)證候類型患兒的療效雖有差別,但均未達到統(tǒng)計學意義。 6.安全性評價：服用單味黃芪的患兒鼻衄癥狀發(fā)生率相對較高(x2=7.697,P=0.021),其他可能與藥物不良反應相關的癥狀發(fā)生率在中藥與安慰劑之間無顯著性差異。各組患兒的WBC、NEU、PLT及肝腎功能指標在療程結束后的組間差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)；治療前后的差異也無統(tǒng)計學意義(P0.05)。無一例患兒因不良反應而需要停藥。 7.隨訪期指標：中間型及重型復方組及黃芪組患兒在隨訪期內輸血次數(shù)均少于對照組,但差異未達到顯著性(P0.05)。 8.分子生物學實驗結果：實時熒光定量RT-PCR結果顯示,復方組、黃芪組治療后的Gγ珠蛋白基因mRNA均顯著高于治療前水平(分別F=14.152,P=0.004:F=14.854,P=0.002),兩組分別提升了1.65倍及1.53倍,同時也顯著高于對照組(分別P=0.010,P=0.036),提示中藥可在體內誘導患兒Gγ珠蛋白基因的轉錄表達。中藥對患兒αβΑγ珠蛋白基因以及p38MAPK基因的IRNA水平無顯著性影響。Western Blot結果顯示,復方組、黃芪組的磷酸化p38MAPK蛋白水平在治療后均顯著高于治療前(分別t=-4.234,P=0.002:t=-3.953,P=0.002),兩組分別提升了2.3倍及2.21倍,同時也顯著高于對照組(分別P=0.006,P=0.019)；而p38MAPK蛋白水平的前后差異與組間差異則無統(tǒng)計學意義。以上結果提示中藥可在體內促進p38MAPK的磷酸化激活。 結論與展望：綜合以上各部分結果,本研究的結論如下： 1.單味黃芪及黃芪、黨參、龜板組成的小復方中藥口服能顯著提升β地中海貧血患兒的總血紅蛋白水平及HbF水平,并能一定程度上改善患兒的RBC、MCH、網(wǎng)織紅細胞等血液學指標及中醫(yī)四診癥狀。 2.本隨機對照雙盲的前瞻性臨床研究表明,中間型患兒復方組及黃芪組的總有效率分別為63.6%及61.5%,重型患兒復方組及黃芪組的總有效率分別為42.9%及50.0%,均顯著高于安慰劑對照組；中藥對WBC、NEU、PLT及各項肝腎功能指標均無顯著影響,提示黃芪及其復方中藥治療小兒β地貧是具有一定療效且比較安全的。 3.黃芪及其復方中藥口服均可在體內誘導G平珠蛋白基因的表達,Gγ基因mRNA水平分別提升1.53倍及1.65倍,是中藥提升患兒HbF水平以及總血紅蛋白水平的重要機制。 4.黃芪及其復方中藥口服可以增強p地貧患兒體內p38MAPK的磷酸化,p-p38MAPK蛋白水平分別提升2.21倍及2.3倍,提示p38MAK信號通路的激活可能是中藥在體內誘導γ珠蛋白基因表達的機制之一。 本研究對于開拓p地貧的臨床治療新手段具有重要的意義。我國是地貧的高發(fā)區(qū),目前各種治療方法如輸血、鐵螯合治療、干細胞移植、基因治療等均有明顯的缺點。而各種珠蛋白基因誘導的化學藥物在療效與安全性方面也不盡如人意。本研究及課題組系列研究表明,黃芪及其復方治療小兒p地貧不僅具有良好療效,也無細胞毒性、肝腎毒性及骨髓抑制的副作用,顆粒劑型服用也比較方便,患者耐受性及依從性均較佳�？梢灶A期,黃芪及其復方中藥在今后p地貧的臨床治療上具有良好的應用前景。 中藥大多存在多環(huán)節(jié)、多靶點的作用機制。本研究中藥是否還有基因誘導或者改善貧血的其他機制,另外對地貧并發(fā)癥如肝脾腫大、心衰、生長發(fā)育落后以及體內鐵負荷水平的影響如何,還有其遠期療效、長期安全性、最佳療程與用量等等,均需要今后更長期更多指標的研究來證實。本研究選用單味中藥及小復方,有利于進一步研究與分離出有效成分,也有利于挖掘出傳統(tǒng)中醫(yī)治法理論的科學性。本研究及后續(xù)研究對于開發(fā)地貧新藥以及研究人類血紅蛋白的轉換與誘導均有較強的科學價值,對我國南方各省等地貧高發(fā)區(qū)來講具有重要的社會意義及廣闊的應用前景。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R272

【參考文獻】

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本文編號：1682723