本文選題：青春期　切入點(diǎn)：肥胖　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:通過分子生物學(xué)方法,觀察睪酮對青春期雄性大鼠糖脂代謝以及動(dòng)脈損傷的影響,并以原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為研究對象,利用LPS制造血管內(nèi)皮損傷模型,探討含睪酮培養(yǎng)液對血管內(nèi)皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用并基于PI3K信號通路探討睪酮發(fā)揮作用的可能機(jī)制。方法:將21日齡SD雄性大鼠40只,(動(dòng)物房保持12小時(shí)光照與黑暗的循環(huán)交替,每天7:30給予照明)斷奶適應(yīng)性飼養(yǎng)1天后,隨機(jī)分為正常對照組(normal control group,NC),高脂組(high fat diet,FC),高脂+低劑量睪酮補(bǔ)充組(high fat diet+low dose testosterone,FLT)以及高脂+高劑量睪酮補(bǔ)充組(high fat diet+high dose testosterone,FHT),每組各10只。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng),其他實(shí)驗(yàn)組均以高脂飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)3周后,以高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠體重超過正常對照組大鼠體重20%的定為成功造模的肥胖大鼠模型,其余未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的鼠棄去。各組大鼠均為42日齡(即青春期開始),FC組每日給予過濾除菌的花生油皮下注射,睪酮融于花生油中,制備成12.5ug/kg以及25ug/kg溶劑,FLT組每日給予12.5ug/kg睪酮皮下注射,FHT組每日給予25ug/kg睪酮皮下注射。給藥共4周,期間各組大鼠均按原飼料喂養(yǎng)。生長至10周末,分別測量大鼠體重,禁食12小時(shí)后取內(nèi)眥靜脈血監(jiān)測空腹血糖(Fasting blood glucose,FPG)、空腹胰島素(Fasting insulin,FINS)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、睪酮(Testosterone,T)、雌二醇(Estradiol,E2),計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)與非高密度脂蛋白(Non-high density lipoprotein,non-HDL)。取血后將各組大鼠處死,取各組大鼠腹主動(dòng)脈,利用HE染色的方法觀察各組大鼠腹主動(dòng)脈的病理形態(tài)改變有無差別,采用免疫組化、western blot、PCR方法檢測PI3K、IRS-1、AKT、GLUT-4、NF-κB、TNF-α在各組大鼠動(dòng)脈壁中的表達(dá)含量。利用Tunel染色比較各組大鼠動(dòng)脈壁細(xì)胞凋亡情況。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較各指標(biāo)在四組大鼠中的表達(dá)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并對睪酮濃度與各個(gè)生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,根據(jù)r值大小明確睪酮與各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)程度。1mg/ml的II型膠原酶灌注消化法分離提取HUVEC細(xì)胞。達(dá)到80%以上貼壁融合后傳代培養(yǎng)并鑒定,采用6代以內(nèi)huvecs用于以下實(shí)驗(yàn)。分別以濃度為0ug/ml、1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml含lps培養(yǎng)液刺激6h、12h和24h后,用mtt法比較各組huvecs的增殖情況,根據(jù)結(jié)果選擇合適的lps刺激濃度,建立細(xì)胞損傷模型。再采用六種梯度濃度的睪酮培養(yǎng)液,分為lps+10-6mol/lt組,lps+10-7mol/lt組,lps+10-8mol/lt組,lps+10-9mol/lt組,lps+10-10mol/lt組和lps+10-11mol/lt組,處理細(xì)胞,進(jìn)行mtt、transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),根據(jù)結(jié)果選擇最佳含睪酮培養(yǎng)液的濃度。以下實(shí)驗(yàn)選擇最佳濃度的lps和含睪酮培養(yǎng)液,將細(xì)胞隨機(jī)分為3組:正常對照組(control組)、lps模型組和lps+最佳濃度睪酮組。應(yīng)用tunel試劑盒檢測各組細(xì)胞凋亡情況,利用免疫熒光、western和pcr技術(shù)檢測各組細(xì)胞內(nèi)pi3k信號通路中各指標(biāo)的表達(dá)水平。結(jié)果:1.fc組大鼠體型較nc組明顯肥碩;fc組大鼠體重與nc組大鼠相比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,青春期肥胖大鼠造模成功(p0.05)。fc組大鼠空腹血糖、胰島素、homa-ir、tc、non-hdl、e2顯著高于nc組(p0.05),hdl、t顯著低于nc組(p0.05),flt組大鼠空腹血糖、胰島素、homa-ir、tc、non-hdl、e2顯著低于fc組(p0.05),flt組大鼠hdl、t顯著高于fc組(p0.05)。fht組大鼠空腹血糖、胰島素、homa-ir、tc、non-hdl、e2顯著高于nc組(p0.05),fht組大鼠空hdl、t顯著高于nc組(p0.05)。2.he染色顯示:nc組大鼠血管內(nèi)皮和外膜邊界清晰,內(nèi)彈性模完整,血管壁薄厚均勻,血管各層細(xì)胞排列整齊;fc組與fht組大鼠血管內(nèi)膜外膜邊界欠清,細(xì)胞各層細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核極性差;flt組大鼠血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整,各層細(xì)胞排列整齊。3.免疫組化、westernblot、pcr結(jié)果顯示fc組、fht組pi3k、nf-κb與tnf-α的表達(dá)量明顯高于nc組(p0.05),akt、irs-1與glut-4的表達(dá)量明顯低于nc組(p0.05);flt組pi3k、nf-κb與tnf-α的表達(dá)量明顯低于fc組(p0.05),akt、irs-1與glut-4的表達(dá)量明顯高于fc組(p0.05)。4.相關(guān)分析顯示:nc組、fc組與flt組fpg、fins、homa-ir、tc、non-hdl隨睪酮的升高而下降,hdl隨睪酮的升高而升高;fht組fpg、fins、homa-ir、tc、non-hdl隨睪酮升高而升高,hdl隨睪酮升高而下降。5.成功提取并培養(yǎng)huvec原代細(xì)胞,利用兔抗人viii因子抗體進(jìn)行免疫組化染色鑒定,結(jié)果均為陽性表達(dá)。6.mtt結(jié)果顯示10ug/ml濃度lps作用6小時(shí)可以使細(xì)胞生長受到抑制,與正常對照組相比具有顯著性差異(p0.05),以10ug/ml濃度lps作用6小時(shí)制備內(nèi)管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。7.mtt法、transwell小室以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明,生理濃度睪酮培養(yǎng)液,即10-9mol/l睪酮培養(yǎng)液可以顯著改善lps導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性以及遷移能力的下降(p0.05)。在達(dá)到生理濃度之前,睪酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞活性以及遷移能力的作用隨濃度升高而提升,高于生理濃度時(shí)睪酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞活性以及遷移能力的作用隨濃度升高而下降(p0.05)。8.tunel染色顯示lps模型組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于正常對照組(p0.05),lps+10-9mol/l睪酮培養(yǎng)液組細(xì)胞凋亡指數(shù)亦高于正常對照組,但顯著低于lps模型組(p0.05)。9.細(xì)胞免疫熒光顯示,與正常對照組相比較,lps模型組與lps+生理睪酮處理組的細(xì)胞內(nèi)glut-4熒光強(qiáng)度表達(dá)顯著下降,組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01);與lps模型組比較,生理濃度睪酮處理組的huvecs細(xì)胞內(nèi)glut-4熒光強(qiáng)度表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。與正常對照組相比較,lps模型組與生理睪酮處理組的細(xì)胞內(nèi)nf-κb熒光強(qiáng)度表達(dá)顯著升高,組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,與lps模型組比較,生理濃度睪酮處理組的huvecs細(xì)胞內(nèi)nf-κb熒光強(qiáng)度表達(dá)顯著下降(p0.001)。10.westernblot、pcr結(jié)果顯示irs-1、akt和glut-4在正常對照組中表達(dá)豐富,在lps模型組中的表達(dá)較正常對照組明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p㩳0.05),在lps+生理濃度睪酮組中的表達(dá)較lps模型組明顯增加(p㩳0.05)。nf-κb、pi3k和tnf-α蛋白在正常對照組中表達(dá)不豐富,在lps模型組中的表達(dá)較正常對照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p㩳0.05),在lps+生理濃度睪酮組中的表達(dá)較lps模型組明顯降低(p㩳0.05)。結(jié)論:1.斷乳21天幼鼠連續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)3周,青春期肥胖大鼠模型可成功建立。高脂飲食喂養(yǎng)青春期大鼠可以引起睪酮水平下降、糖代謝異常、血脂紊亂、動(dòng)脈壁呈損傷性病理改變。2.外源性生理劑量睪酮可以減輕高脂飲食造成的糖代謝異常、血脂紊亂、動(dòng)脈壁病理損傷性改變;外源性高劑量睪酮會進(jìn)一步加重糖代謝異常、血脂紊亂、動(dòng)脈壁病理結(jié)構(gòu)改變,說明外源性睪酮對肥胖青春期大鼠的作用有劑量依賴性。3.外源性睪酮對糖脂代謝以及動(dòng)脈壁形態(tài)的作用可由PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)。4.生理濃度含睪酮培養(yǎng)液可以有效改善LPS導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性降低、遷移能力下降以及凋亡指數(shù)增加等損害。5.睪酮對LPS刺激的HUVEC的保護(hù)作用在低于生理濃度時(shí),存在濃度依賴作用;高于生理濃度時(shí),睪酮的保護(hù)作用隨濃度的增加而下降。6.睪酮對LPS刺激的HUVEC保護(hù)作用的機(jī)制與抑制NF-κB、PI3K和TNF-α表達(dá),增加IRS-1、AKT和GLUT-4的表達(dá)有關(guān)。PI3K/AKT信號通路是睪酮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的可能途徑。
[Abstract]:Objective : To observe the effects of testosterone on glycolipid metabolism and arterial injury in adolescent male rats by molecular biological method . The rats were randomly divided into normal control group ( NC ) , high fat diet ( FC ) , high fat diet + low dose testosterone ( FC ) , high fat diet + low dose testosterone ( FC ) , high fat diet + low dose testosterone ( FHT ) . 鎬昏儐鍥洪唶(Total cholesterol,TC),楂樺瘑搴﹁剛铔嬬櫧(High-density lipoprotein,HDL),鐫鵑叜(Testosterone,T),闆屼簩閱，

本文編號：1676779