本文選題：人巨細(xì)胞病毒　切入點：糖蛋白H　出處：《華中科技大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的 本文主要研究嬰幼兒人巨細(xì)胞病毒（HCMV）臨床分離株包膜糖蛋白H（gH）的基因多態(tài)性，分析該基因不同型別在HCMV感染引起的不同疾病中的分布情況及其與不同疾病之間的關(guān)系，為進(jìn)一步了解HCMV致病機(jī)理及亞單位疫苗研究提供參考。 方法 1、HCMV臨床分離株的分離培養(yǎng)：取患兒尿液標(biāo)本接種于人胚肺細(xì)胞孵育8-12小時后換液，連續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞發(fā)生病變（CPE），再取上清液接種于新鮮人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至CPE達(dá)80%-90%病變時收集和保存。 2、gH基因分型：應(yīng)用巢式PCR擴(kuò)增HCMV臨床分離株和AD169株gH基因，核苷酸純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶HhaI酶切，酶切片段經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，比對分型。 3、gH基因序列多態(tài)性分析：將部分PCR擴(kuò)增陽性的產(chǎn)物純化后測序，與AD169株、Towne株序列進(jìn)行比對，用DNAsis軟件分析。 結(jié)果 1、HCMV臨床分離株的分離培養(yǎng)：共選擇105例樣本進(jìn)行分離，最終CPE陽性病毒株50株，分離成功率為47.6%。 2、gH基因分型：經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增，50例臨床分離株中有34例（14例為嬰兒肝炎綜合征，12例為無黃疸型肝炎，5例為肺炎，1例為先天性CMV感染）gH基因陽性，陽性率為68%；分型顯示，gH1型21株，占61.8%；gH2型13株，占38.2%；未見混合型和發(fā)現(xiàn)新的型別，gH基因型別在不同疾病間呈散在分布(X2=0.336,P0.05)。 3、gH基因序列多態(tài)性分析：隨機(jī)挑選15株gH基因陽性標(biāo)本測序分型并與AD169和Towne株序列比對，gH1型有10株，gH2型有5株，其結(jié)果與酶切分型結(jié)果完全符合。其中所選的第2、4、5、6、7、9、10、11臨床株堿基序列相同，編碼的氨基酸也相同，同源性為100%，與AD169株核苷酸相似性、氨基酸一致性分別為97.2%、95.52%，同源性較高；第8、12、14臨床株堿基序列、氨基酸相同，相互間同源性也高達(dá)100%，與TOWNE株核苷酸相似性為99.53%，氨基酸一致性為95.52%。gH序列變異以核苷酸替換為主，也可見插入和缺失突變；與AD169株相比，核苷酸相似性為89.1%～97.2%，氨基酸一致性為74.24%～95.52%；與TOWNE株相比核苷酸相似性為91.12%～99.53%，氨基酸一致性為80.06%～98.5%。DNA變異位點分布比較散在；氨基酸變異相對集中，，與AD169相比，氨基酸變異集中在41～87位點，與TOWNE株比對則集中于33～74位點。 結(jié)論 1、嬰幼兒HCMV臨床分離株gH基因型別以gH1為主，gH基因型別在嬰兒肝炎綜合征、無黃疸型肝炎、肺炎疾病中的分布未見明顯差異。 2、不同HCMV臨床分離株gH基因相對保守但仍存在一定的多態(tài)性。 3、未發(fā)現(xiàn)HCMV gH基因多態(tài)性與不同臨床疾病的關(guān)聯(lián)性。
[Abstract]:Purpose. In this paper, we studied the gene polymorphism of human cytomegalovirus (HCMV) in infants and young children, and analyzed the distribution of different types of the gene in different diseases caused by HCMV infection and its relationship with different diseases. It provides a reference for further understanding the pathogenesis of HCMV and the study of subunit vaccine. Method. 1 isolation and culture of HCMV clinical isolates: urine samples of children were inoculated with human embryonic lung cells for 8 to 12 hours after incubation, The supernatant was collected and stored in fresh human embryonic lung fibroblasts cultured to 80% to 90% CPE. 2G H genotyping: HCMV clinical isolates and AD169 strains were amplified by nested PCR. The PCR products were purified by nucleotide purification kit. The PCR products were digested with restriction endonuclease HhaI, and the fragments were digested by 12% polyacrylamide gel electrophoresis, silver staining and typing. Sequence Polymorphism Analysis of 3G H Gene: partial PCR amplified positive products were sequenced and compared with AD169 strain Towne strain. The results were analyzed by DNAsis software. Results. 1. Isolation and culture of clinical isolates of HCMV: a total of 105 samples were selected for isolation, 50 strains of CPE positive virus strains were isolated, the success rate of isolation was 47.6%. 2G H genotyping: among 50 clinical isolates amplified by nested PCR, 34 cases were infantile hepatitis syndrome, 12 cases were non-jaundice type hepatitis, 5 cases were pneumonia, 1 case was congenital CMV infection, the positive rate was 68%. There were 13 strains of GH2 type, 38.2%, and no mixed type and new type G H genotype were scattered among different diseases. (3) Polymorphism analysis of GH gene: 15 samples were randomly selected for sequencing and typing, and compared with AD169 and Towne strains, there were 10 strains of GH1 type and 5 strains of GH 2 type. The results were in good agreement with the results of enzyme digestion typing, in which the clinical strains of the second strain were the same in base sequence, encoding the same amino acids, the homology was 100, the nucleotide similarity with the AD169 strain and the amino acid consistency were 97.2and 95.52, respectively, with high homology, and the results showed that the nucleotide sequence of the clinical strain was the same as that of the AD169 strain, and the amino acid sequence of the clinical strain was the same as that of the other two strains. The nucleotide similarity with TOWNE strain was 99.53, the amino acid identity was mainly nucleotide substitution, insertion and deletion mutation was also seen, and compared with AD169 strain, the nucleotide similarity was 99.53. The nucleotide similarity was 89. 1 and 97. 2 and the amino acid consistency was 74. 24 and 95.52. Compared with the TOWNE strain, the nucleotide similarity was 91. 12 and 99. 53, and the amino acid identity was the distribution of the 80.06%~98.5%.DNA mutation site. The amino acid variation was relatively concentrated, and compared with the AD169, the amino acid variation was concentrated at 41. 87 sites. Compared with TOWNE strain, it was located at 3374 locus. Conclusion. 1. There was no significant difference in the distribution of G H genotype in infantile hepatitis syndrome, no jaundice hepatitis and pneumonia. 2, the gh gene of different HCMV clinical isolates is relatively conserved but still has certain polymorphism. 3. No association between HCMV gh gene polymorphism and different clinical diseases was found.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R725.1

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本文編號：1653202