本文選題：乙肝疫苗　切入點(diǎn)：免疫接種　出處：《浙江大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的乙型肝炎病毒(HBV)感染的慢性化,以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展的肝硬化、原發(fā)性肝癌(HCC)嚴(yán)重威脅著國(guó)人的身心健康。我國(guó)是乙肝的高發(fā)地區(qū),約有1.2億人為HBV攜帶者,5歲以下兒童有1.0%。由于超過(guò)90%的圍產(chǎn)期感染嬰兒最終會(huì)發(fā)展為慢性感染,因此早期有效地預(yù)防,對(duì)最終控制HBV流行具有重要意義。接種乙型肝炎疫苗(HepB)是預(yù)防和控制乙型肝炎的有效措施,乙肝疫苗的問(wèn)世和普及顯著減少了慢性乙肝的發(fā)病率,甚至逐漸減少在高發(fā)區(qū)肆虐的HBV導(dǎo)致的肝硬化和HCC。我國(guó)早在20年前就已將乙肝疫苗預(yù)防接種納入免疫規(guī)劃管理,其近期保護(hù)效果也已被大量的應(yīng)用證實(shí)。但在疫苗的使用中,仍存在著乙肝疫苗接種覆蓋率及依從性的地區(qū)性差異,另一個(gè)更難以解決的問(wèn)題是:疫苗接種后表現(xiàn)無(wú)應(yīng)答或弱應(yīng)答,即免疫失敗。免疫失敗者因不能受乙肝疫苗的有效保護(hù),成為HBV感染的高危人群。本課題通過(guò)研究和探討本地區(qū)學(xué)齡前兒童乙肝疫苗接種依從性、疫苗免疫的成功率,并進(jìn)一步分析免疫細(xì)胞亞群變化與疫苗免疫效果的相關(guān)性,探明學(xué)齡前兒童乙肝疫苗應(yīng)答的差異及其相關(guān)免疫因素,為當(dāng)?shù)貎和腋蔚念A(yù)防與控制提供依據(jù)。對(duì)象和方法1研究對(duì)象研究納入了 1965例來(lái)自浙江臨安地區(qū)的學(xué)齡前兒童,采用隨機(jī)抽樣方法,對(duì)2015年1月至2016年5月至上述地區(qū)進(jìn)行體檢的入托或入學(xué)兒童的乙肝疫苗接種情況等進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查。并對(duì)其中813例進(jìn)行了細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)。2實(shí)驗(yàn)方法(1)調(diào)查表設(shè)計(jì)通過(guò)設(shè)計(jì)包含研究對(duì)象基本信息及乙肝疫苗接種史、乙肝家族史等相關(guān)信息的調(diào)查表,按照統(tǒng)一問(wèn)卷調(diào)查,對(duì)每個(gè)調(diào)查對(duì)象及其父母或監(jiān)護(hù)人進(jìn)行面對(duì)面調(diào)查。(2)樣本采集在現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查的同時(shí),簽署知情同意書(shū),對(duì)被調(diào)查的兒童采集靜脈血2-5mL,及時(shí)運(yùn)送至指定檢測(cè)點(diǎn)(浙大一院),分離血清、PBMC,分別進(jìn)行乙肝三系及細(xì)胞免疫應(yīng)答指標(biāo)檢測(cè)。(3)HBV病毒學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)及判斷標(biāo)準(zhǔn)HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe及抗-HBc采用微粒子酶聯(lián)免疫法(MEIA)檢測(cè)。HBsAg≥0.05 IU/mL、HBeAg(s/co)≥ 1.000、抗-HBc(s/co)≥ 1.000、抗-HBe(s/co)1.000、抗-HBs ≥ 10 IU/L 為陽(yáng)性(+)。乙肝疫苗免疫效果定義:HBV血清標(biāo)志物均為陰性且抗-HBs10 IU/L,視為疫苗接種無(wú)應(yīng)答;單純抗-HBs陽(yáng)性且10IU/L≤抗-HBs100IU/L,視為疫苗接種低應(yīng)答;單純抗-HBs陽(yáng)性且抗-HBs≥100IU/L,視為疫苗接種高應(yīng)答。(4)外周血淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)取100μl抗凝血置于各流式管中,加入CD3-PerCP-Cy5.5,CD4-APC,CD8-APC-Cy7 抗體各 20 μl,同時(shí)做相應(yīng)的同型對(duì)照,混勻后,室溫避光孵育30min,Coulter QPREP標(biāo)本處理儀(美國(guó)Beckman coulter公司)進(jìn)行紅細(xì)胞裂解及細(xì)胞固定,在流式細(xì)胞儀(Coulter Cytomics FC 500,美國(guó)Beckman Coulter公司)上計(jì)數(shù)1×104以上細(xì)胞,分別記錄CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分率。同理,通過(guò)CD19-APC-Cy7、CXCR5-FITC熒光抗體檢測(cè)外周血B淋巴細(xì)胞群及濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper,Tfh)。(5)CD45RA、CD45RO細(xì)胞檢測(cè)采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC),取100μlPBMC加入各管,然后依次加入20μl單克隆熒光抗體anti-CD45RO-PE、anti-CD45RA-FITC、anti-CD4-APC、anti-CD8-APC-Cy7充分混勻,避光,孵育15min;經(jīng)洗滌后,加500μl PBS,振蕩混勻,上機(jī)。以淋巴細(xì)胞設(shè)門,采用雙色免疫熒光技術(shù),分析淋巴細(xì)胞免疫表型CD4+CD45RO+、CD4+CD45RA+、CD8+CD45RO+、CD8+CD45RA+,每管細(xì)胞獲取數(shù)目10000個(gè),結(jié)果用EXP032(BeckmanCoulter)軟件獲取與分析數(shù)據(jù)。(6)ELISPOT檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)因子采用ELISPOT法檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2/IL-4、IL-5、IL-10)的變化。方法如下:調(diào)整PBMC濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/ml,將其加入到抗體預(yù)包被的ELISPOT板上,100μl/孔,加入特異性刺激多肽,并設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照,加入10%FCS培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育16-20小時(shí);PBS洗滌后,加入相應(yīng)的二抗抗體,避光室溫孵育;再次洗滌后,加入酶標(biāo)親和素避光室溫孵育,洗滌后加入顯色液,室溫避光孵育20min;加入終止液,洗板后用ELISPOT斑點(diǎn)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行斑點(diǎn)形成細(xì)胞計(jì)數(shù)(SFC)。(7)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的相關(guān)方法。結(jié)果1學(xué)齡前兒童乙肝疫苗免疫效果調(diào)查分析(1)本研究共采集0-8歲人群血清標(biāo)本1965例,其中資料完整者1695例,而按標(biāo)準(zhǔn)方案完成全程接種者1591例,乙肝疫苗接種率93.86%,男、女童接種率相似(93.68%vs 94.07%),0-2歲接種率95.34%(654/686),3-5歲接種率93.36%(914/979),6-8歲接種率76.67%(23/30)。(2)完成全程乙肝疫苗接種者,抗-HBs的陽(yáng)性率為78.50%(1249/1591),0-2歲兒童抗-HBs陽(yáng)性率高于3-5歲的(86.85%vs72.98%),3-5歲兒童抗-HBs陽(yáng)性率高于與6-8歲兒童(72.98%vs 60.87%);不同性別的各年齡段兒童對(duì)疫苗應(yīng)答率無(wú)差異。(3)母親乙肝陽(yáng)性的兒童未加強(qiáng)免疫的抗-HBs陽(yáng)性率低,而加強(qiáng)免疫后的兒童抗-HBs陽(yáng)性率則明顯增高;家族他人乙肝陽(yáng)性對(duì)兒童的應(yīng)答率沒(méi)有影響。2.2乙肝疫苗免疫后低應(yīng)答和無(wú)應(yīng)答者細(xì)胞免疫應(yīng)答變化(1)納入流式檢測(cè)的813例樣本中,1例HBsAg陽(yáng)性,4例抗-HBc陽(yáng)性,余下的808例中:193例血清抗-HBs滴度10 IU/L(無(wú)應(yīng)答組);345例血清抗-HBs滴度10-100IU/L(低應(yīng)答組);270例血清抗-HBs滴度≥100IU/L(高應(yīng)答組)。(2)通過(guò)檢測(cè)不同應(yīng)答組外周血淋巴細(xì)胞、CD3+/CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群,CD4+CD45RO+T 細(xì)胞、CD4+CD45RA+T 細(xì)胞及 CD8+CD45RO+T 細(xì)胞、CD8+CD45RA+T細(xì)胞的百分率發(fā)現(xiàn),免疫無(wú)或低應(yīng)答組CD8+T細(xì)胞、CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞、CD8+CD45RA+效應(yīng)性T細(xì)胞、Tfh細(xì)胞明顯增多,與高應(yīng)答組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而外周血淋巴細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD4+CD45RA+效應(yīng)性T細(xì)胞在無(wú)或低應(yīng)答組中低于高應(yīng)答組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);外周血CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞和CD8+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)各應(yīng)答組間Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)分析顯示,免疫無(wú)應(yīng)答或低應(yīng)答組與高應(yīng)答組相比Th1相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ表達(dá)明顯增多,而Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-10表達(dá)減少明顯,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而IL-5表達(dá)在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論本地區(qū)乙肝疫苗接種率總體較好、依從性較強(qiáng);疫苗免疫效果隨著年齡的增加逐漸降低,2歲到5歲間下降尤為顯著;各年齡段不同性別間兒童對(duì)疫苗應(yīng)答率相似;母親乙肝陽(yáng)性的兒童加強(qiáng)免疫后的兒童抗-HBs陽(yáng)轉(zhuǎn)率則明顯增高,而家族他人乙肝陽(yáng)性對(duì)兒童的應(yīng)答率無(wú)影響。細(xì)胞免疫結(jié)果顯示,學(xué)齡前兒童外周血淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群、CD45RO+記憶性T細(xì)胞、CD45RA+效應(yīng)性T細(xì)胞、Tfh細(xì)胞及Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子存在明顯差異,可能是影響基因重組乙肝疫苗免疫效果的機(jī)體內(nèi)在因素。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R725.1
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本文編號(hào)：1570626