發(fā)布時間：2018-02-01 03:02

  本文關(guān)鍵詞： 膽道閉鎖 全基因組甲基化芯片 DNA甲基化 IFN-γ 膽道閉鎖 CD4+T淋巴細胞 DNA甲基化 IFN-γ 膽道閉鎖 ERK信號通路 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1 Jurkat細胞　出處：《復旦大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：膽道閉鎖(Biliary Atresia, BA)是新生兒膽汁淤積的常見病因,亦是兒童最常見的嚴重肝臟疾病,以肝內(nèi)和肝外膽管的進行性炎癥和纖維性梗阻為特征,從而導致膽汁淤積以及進行性的肝纖維化和肝硬化,不手術(shù)治療很少能活過2歲。即使成功進行了Kasia手術(shù)并重建膽汁流出道,仍然有68%-80%膽道閉鎖患兒在手術(shù)后因為各級膽管進行性梗阻及炎癥損傷,導致膽汁淤積和肝纖維化加重,進展為肝功能衰竭,最終需要接受肝臟移植。肝內(nèi)膽道上皮細胞炎癥損傷、凋亡和肝纖維化、肝硬化是膽道閉鎖的主要病理改變,其發(fā)生和發(fā)展機制尚不明確。一般認為其發(fā)病機制涉及病毒感染、自身免疫介導的膽管破壞及膽道發(fā)育異常；是一種病毒介導的自身免疫性疾病,主要是CD4+Thl介導的自身免疫反應(yīng)過程。同卵雙胎兒并沒有同時發(fā)展為BA,說明非遺傳性因素在BA發(fā)病中起著重要作用。為進一步闡明該病的發(fā)病機制,本研究借助全基因組甲基化芯片及生物信息學技術(shù)對BA外周血單個核細胞中全基因甲基化狀態(tài)及相互關(guān)系進行研究；然后對甲基化敏感免疫相關(guān)基因IFN-γ在膽道閉鎖中的表達情況進行研究,并探討ERK信號通路在膽道閉鎖中的表達情況以及與DNA甲基化異常的關(guān)系。 第一部分膽道閉鎖患兒外周血單個核細胞全基因組甲基化狀態(tài) 目的利用全基因組甲基化芯片技術(shù)及生物信息學方法對膽道閉鎖患兒外周血單個核細胞的全基因組甲基化狀態(tài)進行研究,以進一步闡明該病的發(fā)病機制。 方法采集膽道閉鎖患兒和正常健康兒外周靜脈血,淋巴細胞分離液分離單個核細胞,提取DNA,經(jīng)DNA甲基化修飾試劑盒處理后,采用人類全基因組甲基化芯片(450K Infinium Methylation BeadChip)對全基因組中大于450000的CpG島或CpG位點進行差異甲基化分析。每個CpG位點設(shè)計兩個探針：甲基化和去甲基化探針。對所得差異基因甲基化位點進行校正方法及差異分析。 結(jié)果在膽道閉鎖患兒的DNA中共篩選出5611個差異甲基化位點,其中4300個發(fā)生低甲基化,1311個發(fā)生高甲基化,分別代表1375和704個基因,差異均有顯著性意義(p0.05)。根據(jù)基因的功能不同,再進一步增加限定條件后,篩選出免疫相關(guān)基因的差異甲基化位點133個,其中低甲基化位點87個,高甲基化位點46個,分別代表25和19個基因,差異均有顯著性意義(p0.05)。而在膽道閉鎖免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用的甲基化敏感基因干擾素-γ(IFN-γ)亦具有明顯的低甲基化趨勢。 結(jié)論膽道閉鎖患兒外周血單個核細胞全基因中低甲基化的位點占據(jù)明顯優(yōu)勢,免疫相關(guān)基因的低甲基化位點明顯增多,其中甲基化敏感免疫相關(guān)基因IFN-γ處于低甲基化狀態(tài)。本部分研究為膽道閉鎖發(fā)病機制的研究提供了新的切入點。 第二部分膽道閉鎖患兒外周血CD4+T淋巴細胞的整體甲基化狀態(tài)及甲基化敏感基因IFN-ff的表達研究 目的研究膽道閉鎖患兒外周血CD4+T淋巴細胞的整體甲基化狀態(tài)和干擾素-γ(IFN-γ)基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài),并觀察IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄水平表達情況。 方法選取15例膽道閉鎖及12例健康對照組進行對比研究；提取外周血CD4+T淋巴細胞的DNA和RNA；采用通用甲基化定量試劑盒檢測整體甲基化胞嘧啶表達水平；實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)檢測DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)、甲基化CpG結(jié)合蛋白(MBDs)和IFN-γ的mRNA表達水平。亞硫酸氫鈉-測序法檢測IFN-y啟動子區(qū)DNA甲基化水平。 結(jié)果膽道閉鎖組CD4+T淋巴細胞中的整體平均甲基化水平明顯低于對照組(p0.0001)。與對照組相比,膽道閉鎖組CD4+T細胞中DNMT1和DNMT3a在轉(zhuǎn)錄水平表達明顯降低(p值分別為0.0012和0.0210)。膽道閉鎖組CD4+T細胞中MBD1轉(zhuǎn)錄水平表達明顯低于對照組(p=0.0029),而MBD4轉(zhuǎn)錄水平表達明顯升高(p=0.0199)；DNMT3b、MBD2和MeCP2在膽道閉鎖組與對照組之間無明顯統(tǒng)計學意義。膽道閉鎖組CD4+T細胞中DNMT1轉(zhuǎn)錄水平表達與整體DNA甲基化水平呈正性相關(guān)(r=0.6290,p=0.0120)。與對照組相比,IFN-y在膽道閉鎖組CD4+T細胞中表達明顯升高(p=0.0376),其啟動子區(qū)域處于低甲基化狀態(tài),并與整體DNA甲基化水平呈負性相關(guān)(r=-0.5720,p=0.026)。 結(jié)論膽道閉鎖患兒外周血CD4+T細胞中整體平均甲基化水平低下；在膽道閉鎖CD4+T細胞中,IFN-y基因啟動子區(qū)域亦處于低甲基化狀態(tài),與整體DNA甲基化水平呈負性相關(guān),該現(xiàn)象可能與膽道閉鎖發(fā)病有一定關(guān)系。 第三部分膽道閉鎖患兒外周血CD4+T淋巴細胞ERK信號通路的狀態(tài)及與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1的關(guān)系 目的研究膽道閉鎖患兒外周血CD4+T淋巴細胞中細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路的狀態(tài),探討其與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的關(guān)系；并在體外Jurkat細胞中進行驗證。 方法選取20例膽道閉鎖患兒及15例健康對照組進行對比研究；提取外周血CD4+T淋巴細胞蛋白質(zhì),采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western-blot)檢測ERK信號通路關(guān)鍵分子ERK1/2及其磷酸化水平(p-ERK1/2),并檢測DNMT1的表達情況；用20mM的PD98059處理Jurkat細胞,提取蛋白質(zhì),Western-blot檢測處理前后ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白水平以及DNMT1的表達情況。 結(jié)果與對照組相比較,膽道閉鎖中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平均明顯下降,DNMT1的蛋白表達水平亦明顯下降(p值均小于0.05)。相對于未處理組,PD98059處理的Jurkat細胞中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水均明顯下降,DNMT1的蛋白表達水平亦明顯下降(p值均小于0.05)。 結(jié)論膽道閉鎖中ERK信號通路關(guān)鍵分子ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平下降可能是導致DNMT1蛋白表達水平下降的原因,并可能使膽道閉鎖患兒外周血CD4+T淋巴細胞基因組DNA發(fā)生整體低甲基化。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R726.5

【參考文獻】

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本文編號：1480751