發(fā)布時(shí)間：2017-12-11 19:21

  本文關(guān)鍵詞：小兒胃腸積熱證與腸道微生態(tài)失調(diào)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)與臨床研究

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【摘要】：胃腸積熱是由無形熱邪或有形熱結(jié)壅于胃腸所導(dǎo)致的胃腸陽熱偏盛的狀態(tài)�；谛旱纳怼⒉±硖攸c(diǎn),其極易傷于飲食而發(fā)為胃腸積熱之證。本研究采用高通量測序的方法檢測胃腸積熱證幼鼠模型及胃腸積熱小兒腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化,以菌群多樣性及優(yōu)勢菌群的相對豐度為主要指標(biāo),探索小兒胃腸積熱證與腸道微生態(tài)失調(diào)之間的相關(guān)性,完善小兒胃腸積熱證的相關(guān)病機(jī)學(xué)研究,為其證候內(nèi)涵的現(xiàn)代化解讀提供新視角與新思路,指導(dǎo)小兒胃腸積熱證的臨床預(yù)防與治療。論文共分為文獻(xiàn)綜述、實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究三部分。第一部分文獻(xiàn)綜述方法：通過查閱、整理古今文獻(xiàn),總結(jié)歸納胃腸積熱的病因、病機(jī)及其在現(xiàn)代社會(huì)多發(fā)的原因,并對系統(tǒng)生物學(xué)在胃腸積熱病因、病機(jī)學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)行展望；對腸道微生態(tài)系統(tǒng)的組成及作用、微生態(tài)平衡的特性及其個(gè)性化特征的影響因素、微生態(tài)失調(diào)的病因及其表現(xiàn)形式進(jìn)行分類概括,并簡單闡述腸道微生態(tài)失調(diào)與疾病的相關(guān)性,對腸道微生態(tài)在中醫(yī)藥研究中的重要性及發(fā)展前景加以分析。結(jié)果與結(jié)論：文獻(xiàn)研究表明,胃腸積熱或因過食肥甘厚味導(dǎo)致陽氣內(nèi)郁、蘊(yùn)于胃腸,或因情志不遂、氣郁化火、壅于胃腸,或因外邪直中或傳變至陽明胃腸、從陽化熱、邪熱壅塞而成；在現(xiàn)代病機(jī)學(xué)研究中,其發(fā)病主要與免疫紊亂、神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、營養(yǎng)障礙等密切相關(guān)；而飛速發(fā)展的現(xiàn)代社會(huì)所帶來的飲食結(jié)構(gòu)的“富營養(yǎng)化”、食品安全問題、繁重的學(xué)習(xí)工作生活壓力及運(yùn)動(dòng)的缺乏等因素則導(dǎo)致其在現(xiàn)代臨床愈加常見。腸道菌群具有調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝、免疫刺激及生物拮抗的作用,在不同分娩方式、喂養(yǎng)方式的嬰幼兒及不同年齡、不同地域、不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的人群中即可呈現(xiàn)出腸道微生態(tài)平衡的群體個(gè)性化特征,且在多種外源性(氣候、飲食、環(huán)境污染、病原微生物、食品添加劑)、內(nèi)源性(營養(yǎng)代謝障礙、器官功能失調(diào)、癌癥)及醫(yī)源性(藥物、放化療、外科手術(shù))因素的綜合作用下可表現(xiàn)為菌群比例失調(diào)或定位轉(zhuǎn)移,參與消化系統(tǒng)疾病、代謝性疾病及過敏性疾病的發(fā)生和發(fā)展,為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究開拓了新思路與新方法。第二部分實(shí)驗(yàn)研究目的：通過檢測胃腸積熱幼鼠模型腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化,探索胃腸積熱與腸道微生態(tài)失調(diào)的相關(guān)性,完善胃腸積熱發(fā)病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。方法：通過喂飼高熱量、高蛋白飼料制作胃腸積熱幼鼠模型,無菌采集其與正常對照幼鼠的大腸內(nèi)容物標(biāo)本,采用高通量測序的方法檢測標(biāo)本內(nèi)的腸道菌群,以菌群多樣性及優(yōu)勢菌群的絕對、相對豐度為主要指標(biāo),描述幼鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征,挖掘組間的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異,篩選與幼鼠胃腸積熱相關(guān)的腸道微生態(tài)指標(biāo)。結(jié)果：1 幼鼠的癥狀和體征正常對照組(Normal Control, NC幼鼠精神狀態(tài)良好,行動(dòng)敏捷,皮毛色白、柔順、有光澤,糞便質(zhì)粗而成形,色棕黑。胃腸積熱組(Model, M)幼鼠精神不振,行動(dòng)靈活度稍減,蜷縮,皮毛色微黃、光澤度減弱,糞便質(zhì)粘而軟,色棕黃。2幼鼠的體重胃腸積熱幼鼠的體重顯著低于正常對照幼鼠。3幼鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征胃腸積熱及正常對照幼鼠的腸道菌群種類均呈現(xiàn)多樣化的特征,目前已獲得的物種注釋信息涉及9個(gè)菌門、16個(gè)菌綱、30個(gè)菌目、46個(gè)菌科、57個(gè)菌屬、26個(gè)菌種,其中以注釋到菌科的OTUs為最多,且在菌群豐度方面,在菌科水平,Lachnospiraceae (毛螺菌科)、Bacteroidaceae (擬桿菌科)、S24-7和Ruminococcaceae (瘤胃菌科)占據(jù)絕對優(yōu)勢。4 胃腸積熱與正常對照幼鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異性分析①在Beta多樣性分析中,胃腸積熱與正常對照幼鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)之間具有顯著性差異；②在菌群多樣性方面,Alpha多樣性分析(稀釋度曲線、Chol 1曲線)提示M組雌性幼鼠與NC組雌性幼鼠之間具有顯著性差異,而基于OTUs數(shù)目分布的菌屬、菌種水平上的腸道菌群多樣性分析則提示胃腸積熱與正常對照幼鼠之間存在顯著性差異,且這一差異在雌性幼鼠中表現(xiàn)得更為明顯；③在菌群相對豐度方面,在菌科水平,Lachnospiraceae的減少與胃腸積熱具有明顯的相關(guān)性,而Bacteroidaceae的分布則與性別明顯相關(guān)；5 胃腸積熱幼鼠模型相關(guān)腸道微生態(tài)指標(biāo)的篩選結(jié)合Venn圖、Heatmap及OTUs相對豐度數(shù)據(jù)篩選出胃腸積熱幼鼠模型相關(guān)的腸道微生態(tài)指標(biāo)為OTU 1,物種注釋為p__Firmicutes(厚壁菌門)；c__Clostridia(梭菌綱)；o__Clostridiales (梭菌目)；f__Lachnospiraceae,其相對豐度在胃腸積熱幼鼠模型中呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。結(jié)論：1據(jù)幼鼠體征的改變,判斷胃腸積熱模型復(fù)制成功。2 胃腸積熱與正常對照幼鼠的腸道菌群均呈現(xiàn)多樣化的結(jié)構(gòu)特征；在菌科水平上,以Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、S24-7 和 Ruminococcaceae為絕對優(yōu)勢菌群。3 胃腸積熱幼鼠的腸道微生態(tài)處于失調(diào)狀態(tài),胃腸積熱證的發(fā)生與腸道微生態(tài)失調(diào)具有相關(guān)性。4 胃腸積熱幼鼠模型的腸道微生態(tài)特異性指標(biāo)為OTU_1,其相對豐度的顯著下降與胃腸積熱密切相關(guān)。第三部分臨床研究目的：通過檢測胃腸積熱與健康對照小兒腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化,探索胃腸積熱與腸道微生態(tài)失調(diào)的相關(guān)性,完善胃腸積熱發(fā)病機(jī)制的臨床研究。方法：以《胃腸積熱診斷量表》為準(zhǔn),臨床采集胃腸積熱與健康對照小兒的糞便標(biāo)本,采用高通量測序的方法檢測標(biāo)本內(nèi)的腸道菌群,以菌群多樣性及優(yōu)勢菌群的絕對、相對豐度為主要指標(biāo),描述小兒腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征,挖掘組間的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異,篩選與小兒胃腸積熱相關(guān)的腸道微生態(tài)指標(biāo)。結(jié)果：納入本研究的志愿者共計(jì)50例,其中健康對照男童(Normal Control and Male, NCM) 12例、健康對照女童(Normal Control and Female, NCF) 12例、胃腸積熱男童(Model and Male, MM) 14例、胃腸積熱女童(Model and Female, MF) 12例。1 一般資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),四組小兒在平均年齡及年齡分層、BMI (Body Mass Index,身體質(zhì)量指數(shù))、分娩方式、是否足月分娩、疫苗接種史、益生菌乳制品飲用情況及就餐情況等方面未見顯著性差異。2小兒腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征胃腸積熱與健康對照小兒的腸道菌群種類均呈現(xiàn)多樣化的特征,目前已獲得的物種注釋信息涉及20個(gè)菌門、30個(gè)菌綱、65個(gè)菌目、105個(gè)菌科、156個(gè)菌屬、66個(gè)菌種,其中以注釋到菌屬的OTUs為最多,且在菌群豐度方面,在菌屬水平上占據(jù)絕對優(yōu)勢的菌群為Bacteroides (擬桿菌屬)和Faecalibacterium (柔嫩梭菌屬)3 胃腸積熱與健康對照小兒腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異性分析①在Beta多樣性分析中,胃腸積熱與健康對照小兒的腸道菌群結(jié)構(gòu)之間未見顯著性差異；②在菌群多樣性方面,Alpha多樣性分析及基于OTUs數(shù)目的菌屬、菌種水平上的多樣性分析均提示胃腸積熱與健康對照小兒之間未見顯著性差異；③在菌群相對豐度方面,在菌屬水平,優(yōu)勢菌群Bacteroides 和 Faecalibacterium在胃腸積熱與健康對照小兒腸道菌群之間的分布未見明顯差異；4小兒胃腸積熱相關(guān)腸道微生態(tài)指標(biāo)的篩選結(jié)合Venn圖、Heatmap及OTUs相對豐度數(shù)據(jù)未能篩選出與小兒胃腸積熱相關(guān)的腸道微生態(tài)特征性指標(biāo)。結(jié)論：1 胃腸積熱與健康對照小兒的腸道菌群均呈現(xiàn)多樣化的結(jié)構(gòu)特征；在菌屬水平上,以Bacteroides 和 Faecalibacterium為絕對優(yōu)勢菌群。2 胃腸積熱與健康對照小兒的腸道菌群結(jié)構(gòu)之間未見明顯的差異性,究其原因可能為：①此次納入研究的胃腸積熱小兒證情輕微,腸道菌群尚處于自我調(diào)節(jié)限度之內(nèi)；②胃腸積熱的病位僅限于胃與大腸,對機(jī)體內(nèi)系統(tǒng)微生態(tài)整體的影響尚不足以促使腸道微生態(tài)失調(diào)的發(fā)生；③胃腸積熱可能與腸道黏膜相關(guān)菌群的失調(diào)相關(guān),而糞便樣本主要反映腸腔內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)；④益生菌乳制品對糞便中腸道菌群的影響遠(yuǎn)大于胃腸積熱“內(nèi)證態(tài)”的影響。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R272

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