本文關鍵詞：先天性膽汁酸合成障礙1型和2型臨床特征及基因突變研究

  更多相關文章： 膽汁淤積 膽汁酸 HSD3B7基因 AKR1D1基因 鵝去氧膽酸 AKR1D1基因 錯義突變 定點誘變 轉染 蛋白表達 AKR1D1基因 家系分析 羊水 產前診斷

【摘要】：第一部分先天性膽汁酸合成障礙1型和2型臨床特征及基因突變譜目的：探索先天性膽汁酸合成障礙(CBAS)1型和2型在中國兒童和青少年肝內膽汁淤積癥病因中的地位,分析CBAS1型和2型臨床特征與基因突變譜,為早期診斷提供線索。方法：2009年1月至2014年1月在我院肝病門診就診,表現(xiàn)為膽汁淤積癥或曾有膽汁淤積癥,臨床考慮膽汁酸合成障礙可能或不明原因肝內膽汁瘀積癥者,采用尿液膽汁酸譜分析,基因檢測和全外顯子組測序技術診斷膽汁酸合成障礙。確診CBAS1型和2型病例為研究對象,基因確診的PFIC1型和2型,或曾行尿液膽汁酸譜分析除外膽汁酸合成障礙者為對照組,收集患兒詳細臨床資料,回顧性分析臨床及生化指標并進行統(tǒng)計學檢驗, P值0.05有統(tǒng)計學意義。結果：10例CBAS1患兒HSD3B7基因檢測到14種突變,除c.45_46delAG外均為新發(fā)現(xiàn)的突變,包括G88R、S162P、R228Q、P264T、P264T、T323M、Y344C、 W36C、c.474delC、c.544delC、c.544insC、c.988-990delACC、c.1040delT。5例CBAS2患兒AKR1D1基因檢測到6種突變,Y132X為無義突變,933delG為移碼突變,R266Q與日本報道患兒相同,D53G、D241V和R307C為新發(fā)現(xiàn)的錯義突變。CBAS1和2患兒存在腎臟結構異常的比例(6/12,50%)明顯高于PFIC1和2患兒(1/21)(P值為0.005)。CBAS1和2患兒GGT中位值為44 IU/L(8IU/L-70 IU/L)和TBA中位值為88.25 μmol/L(7.1μmol/L-392.1 μmol/L),明顯低于曾行尿液膽汁酸譜分析排除CBAS患兒(P值分別為0.0036與0.000)。其他生化指標差異無顯著性。經CDCA治療后,多數(shù)CBAS1型和2型患兒黃疸消失,生化指標恢復正常,尿液膽汁酸譜恢復正常。結論：本研究確診10例CBAS1和5例CBAS2患兒,證實了CBAS1和2是我國兒童和青少年肝內膽汁淤積癥的重要病因。CBAS1和2基因突變譜廣泛。腎臟結構異常是一種值得注意的臨床表現(xiàn),血清低GGT與低TBA是CBAS1和2型的主要生化特征。早期采用CDCA治療效果顯著。第二部分AKR1D1基因錯義突變對酶蛋白功能影響的初步探索目的編碼△4-3-氧固醇-5 β-還原酶的AKR1D1基因4種突變D53G、D241V、R266Q和R307C是本課題組檢出的新突變,本研究應用體外表達的方法對這4種錯義突變進行功能分析,初步探索其突變效應和致病性質。方法(1)從肝臟手術廢棄組織中獲得AKR1D1 cDNA;(2)構建野生型表達質粒pcDNA4-AKRlDl;(3)應用定點誘變技術構建含有4種突變型AKR1D1 cDNA的表達載體,轉化感受態(tài)大腸桿菌,抽提質粒并測序驗證；(4)使用pcDNA4. O-EGFP質粒轉染與HEK293細胞摸索最佳轉染條件；(5)將含有野生型和突變型AKR1D1 cDNA的表達載體pcDNA4瞬時轉染HEK293細胞；(6)轉染48小時后抽提蛋白質,應用免疫印跡法檢測蛋白表達量。以野生型AKR1D1作為參照,計算突變型AKR1D1蛋白的相對表達量。各組間統(tǒng)計比較使用t檢驗。結果(1)成功構建了含有AKR1D1基因的野生型及4種突變型質粒：pcDNA4.0-AKR1D1質粒,pcDNA4.0-AKR1D1-D53G質粒,pcDNA4.0-AKR1D1-D241V質粒,pcDNA4.0-AKR1D1-R266Q質粒,pcDNA4.0-AKR1D1-R307C質粒；(2)野生型和突變型AKR1D1蛋白過表達于HEK293細胞；pcDNA4.0-AKR1D1-D53G和pcDNA4.0-AKR1D1-D241V蛋白表達量高于pcDNA4.0-AKR1D1(P值分別為0.041,0.032),pcDNA4.0-AKR1D1-R266Q和pcDNA4.0-AKR1D1-R307C蛋白表達量與pcDNA4.0-AKR1D1蛋白表達量無明顯差異(P值分別為0.485,0.155)。結論成功表達野生型及突變型的AKR1D1于HEK293細胞,4個錯義突變蛋白表達量無明顯降低,對酶功能的影響需要進一步進行酶活性研究。第三部分先天性膽汁酸合成障礙2型一家系突變分析及產前診斷目的 分析已確診的先天性膽汁酸合成障礙2型患兒一家系AKR1D1基因突變情況,探索采用羊水細胞DNA測序進行產前診斷的可行性。方法 采集患兒父母外周血標本,第二胎妊娠20周胎兒羊水細胞及培養(yǎng)兩周后細胞,提取基因組DNA,擴增AKR1D1基因外顯4和外顯子7的編碼區(qū)及側翼序列,采用Sanger法直接雙向測序。采集胎兒出生后外周血標本及小便標本,分別采用血生化化驗、尿膽汁酸譜分析和突變位點檢測進行驗證。結果 患兒為AKR1D1基因,c.396CA和c.722AT復合雜合突變組,患兒父親攜帶AKR1D1基因c.396CA雜合突變,患兒母親攜帶AKR1D1基因c.722AT雜合突變。第二胎妊娠20周胎兒羊水細胞、羊水細胞培養(yǎng)兩周后細胞、及患兒出生后外周血細胞,均未發(fā)現(xiàn)致病突變。胎兒出生后小便未發(fā)現(xiàn)異常膽汁酸。結論AKR1DI基因,c.396CA和c.722AT是該家系的致病突變,直接雙向測序檢測突變位點可對先天性膽汁酸合成障礙家系進行攜帶者篩查及產前診斷。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R725.7

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前1條

1 Jing Zhao;Ling-Juan Fang;Kenneth DR Setchell;Rui Chen;Li-Ting Li;Jian-She Wang;;Primary 4-3-oxosteroid 5β-reductase deficiency:Two cases in China[J];World Journal of Gastroenterology;2012年47期

，

本文編號：1242884