本文關鍵詞：脆性X綜合征相關蛋白FMRP多個亞型的鑒定及其功能研究

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【摘要】：脆性X綜合征（Fragile X syndrome, FXS）是引起遺傳性智力低下的常見疾病之一。FMR1基因三核苷酸重復序列不穩(wěn)定擴增導致脆性X智力低下蛋白（Fragile X mental retardation protein，，FMRP）表達的轉錄沉默是導致FXS的重要原因。已知FMRP的功能實現與其自身結構域的功能和結構密切相關。FMR1在多個物種都存在基因mRNA轉錄本的選擇性剪接，形成不同的轉錄本及蛋白亞型（isoform）。不同的FMRP亞型蛋白可能導致在表達和功能上的重要差異。mFMRP的主要亞型（isoform1）由17個外顯子編碼產生，其它的亞型與之相比均存在不同程度的外顯子序列缺失。最新研究鑒定了mFmr1的12種不同的轉錄本亞型；但目前為止大約有4-5種mFMRP亞型蛋白被鑒定出來。因為目前還沒有蛋白亞型特異性抗體，造成對亞型蛋白的具體功能知之甚少。 本研究采用RT-PCR結合測序的實驗方法，鑒定FVB近交系小鼠的胚胎鼠（E18）和成年鼠（P28）腦組織中mFmr1轉錄本亞型，比較各個亞型的使用頻率。然后采用生物信息學軟件預測這些轉錄本的開放閱讀框（ORF），分析各個亞型蛋白序列的差異。構建體外表達包含V5標簽融合亞型蛋白的質粒，并通過蛋白印跡（Western Blotting）實驗分析各亞型在N1E-115、Neuro-2A、HEK-293細胞系中的分布情況，觀察不同亞型結構對其自身分布的影響。從而探索mFMRP的潛在功能和調控機制。 我們發(fā)現：1、在E18小鼠和P28小鼠全腦組織存在5種序列選擇性剪接模式，對選擇性剪接的發(fā)生位點選擇均符合GT-AG法則，形成了7種不同的mFmr1轉錄本亞型。2、mFmr1轉錄本亞型的分布具有發(fā)育時期特異性，在神經發(fā)育的不同階段可能存在不同的優(yōu)勢類型，使得FMRP與RNA序列的識別和結合功能發(fā)生相應變化，以適應不同生長發(fā)育時期的特殊需要。3、同種mFMRP亞型蛋白在不同類型細胞系中的表達存在差異，在同一細胞系中不同亞型蛋白的分布也存在差異，提示不同的亞型蛋白因結構的差異可使其表達和分布產生差異，影響功能表達。4、V5標簽蛋白在融合蛋白的位置（N-端或C-端）不同影響亞型蛋白的表達和分布。 本研究鑒定了從小鼠腦組織中分離出的7個mFmr1轉錄本亞型，其中Isoform6為首次發(fā)現的亞型，并證實FMRP亞型蛋白在不同細胞系中的表達及分布存在差異，推測在NLS結構域上可能存在關鍵的氨基酸殘基位點，可能影響FMRP的轉運入核功能。本研究為進一步探索mFMRP亞型的具體分布規(guī)律和翻譯調控機制提供了一定的基礎。
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R749.94

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