馬立克氏病毒(Marek′s disease virus, MDV)是α皰疹病毒的成員，基因組為180kb左右的雙股DNA，可引起雞的淋巴細胞瘤。GX0101株MDV是國內(nèi)外從雞體內(nèi)分離到的第一株整合有網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)長末端重復(fù)序列(Long terminal repeat, LTR)的重組野毒株。本實驗室前期研究中已經(jīng)構(gòu)建了GX0101的細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome, BAC)克隆以及敲除REV-LTR的突變株GX0101LTR，證實REV-LTR插入片段顯著增強了GX0101的橫向傳播能力。敲除腫瘤基因meq的突變株GX0101meq病毒不但喪失對SPF雞的致病性，而且不再引起腫瘤以及胸腺和法氏囊萎縮。本學位論文在上述研究的基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建不同的突變株，并以此深入研究MDV相關(guān)的生物學活性和研發(fā)MDV的基因缺失疫苗。 1完成了GX0101株MDV的全基因組序列分析 自然重組病毒GX0101在致病性、免疫原性、橫向傳播能力等方面具有獨特的生物學活性。為了對GX...

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【學位級別】：博士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 馬立克氏病病毒（MDV）的研究進展
        1.1.1 病原學
        1.1.2 流行病學
        1.1.3 病理生物學
        1.1.4 診斷技術(shù)
    1.2 MDV 分子生物學研究進展
        1.2.1 MDV 基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.2 MDV 結(jié)構(gòu)蛋白及相關(guān)基因
    1.3 禽反轉(zhuǎn)錄病毒與 MDV 基因重組的研究進展
        1.3.1 MDV 與 REV 間的基因重組
        1.3.2 MDV 與 ALV 間的基因重組
        1.3.3 REV 與 MDV 基因重組的機制
        1.3.4 帶有 REV-LTR 的重組 MDV 野毒株 GX0101 流行病學意義
    1.4 BAC 技術(shù)和同源重組技術(shù)在 MDV 研究中的應(yīng)用
        1.4.1 細菌人工染色體載體系統(tǒng)(BAC)
        1.4.2 利用 BAC 構(gòu)建 MDV 感染性克隆
        1.4.3 基于 MDV BAC 感染性克隆的同源重組技術(shù)
    1.5 基因芯片技術(shù)在 MDV 研究中的應(yīng)用
        1.5.1 基因芯片的簡介
        1.5.2 基因芯片的應(yīng)用
    1.6 MD 疫苗研究進展
        1.6.1 常規(guī)致弱疫苗
        1.6.2 新型基因工程疫苗
    1.7 本研究的目的及意義
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 常規(guī)分子克隆試劑
        2.1.2 細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑
        2.1.3 熒光定量相關(guān)試劑
        2.1.4 多克隆抗體制備相關(guān)試劑
        2.1.5 Agilent 表達譜芯片相關(guān)試劑
        2.1.6 主要儀器
        2.1.7 相關(guān)疫苗及抗原
        2.1.8 相關(guān)病毒及菌種
        2.1.9 病毒增殖與鑒定相關(guān)試驗材料
    2.2 常規(guī)試驗操作方法
        2.2.1 雞胚成纖維細胞(CEF)的制備
        2.2.2 MDV 的拯救、鑒定
        2.2.3 MDV 的增殖、定量
        2.2.4 MDVBAC 質(zhì)粒的大量制備及電轉(zhuǎn)化
        2.2.5 重組蛋白的純化以及SDS-PAGE 蛋白質(zhì)電泳
        2.2.6 淋巴細胞的分離以及DNA 的提取
        2.2.7 病毒RNA 的提取以及反轉(zhuǎn)錄
    2.3 自然重組馬立克氏病毒 GX0101 的全基因組序列的測定和比較分析
        2.3.1 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 質(zhì)粒的制備
        2.3.2 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 的測序
        2.3.3 GX0101 的全基因組分析
    2.4 以 GX0101 構(gòu)建 meq 基因缺失疫苗候選株及其安全性免疫保護效果的比較研究
        2.4.1 利用同源重組技術(shù)構(gòu)建 SC9-1(GX0101Δmeq kana)株 MDV
        2.4.2 利用同源重組技術(shù)構(gòu)建SC9-2(GX0101 meq kana BAC)株MDV
        2.4.3 SC9-1、SC9-2 株MDV 的拯救、鑒定
        2.4.4 SC9-1、SC9-2 株MDV 在細胞上的復(fù)制水平
        2.4.5 SC9-1、SC9-2 株MDV 對SPF 雞的安全性
        2.4.6 SC9-1 株MDV 在雞體內(nèi)的增殖水平
        2.4.7 SC9-1、SC9-2 株MDV 對SPF 雞的免疫保護效果
        2.4.8 SC9-1 株MDV 對海蘭褐蛋雞的免疫保護效果
        2.4.9 SC9-1 株MDV 對SPF 雞感染低劑量rMd5 的免疫保護效果
    2.5 GX0101 在自然感染傳播過程中競爭性選擇壓優(yōu)勢的模擬分析
        2.5.1 用于區(qū)分MDVGX0101 和GX0101 LTR 的熒光定量PCR 探針設(shè)計
        2.5.2 雙重熒光定量PCR 探針標準曲線的制備
        2.5.3 接種相同劑量GX0101 和GX0101 LTR 后兩種病毒在雞的接觸傳播性比較
        2.5.4 接種不同劑量GX0101 和GX0101 LTR 后兩種病毒在雞的接觸傳播性比較
    2.6 缺失 GX0101 SORF2 基因的重組病毒的構(gòu)建及其生物學活性比較
        2.6.1 鼠抗MDVSORF2 蛋白多克隆抗體制備
        2.6.2 敲除SORF2 基因的重組病毒GX0101Δsorf2 的構(gòu)建
        2.6.3 間接免疫熒光試驗鑒定重組病毒GX0101Δsorf238
        2.6.4 Western blot 對重組病毒GX0101Δsorf2 以及SORF2 蛋白特異性鑒定
        2.6.5 GX0101Δsorf2 在CEF 細胞上的復(fù)制能力的檢測
        2.6.6 GX0101Δsorf2 的致病性試驗
        2.6.7 GX0101Δsorf2 在雞體內(nèi)的的病毒血癥的檢測
        2.6.8 GX0101Δsorf2 對SPF 雞體液免疫應(yīng)答的影響
        2.6.9 GX0101Δsorf2 和GX0101 橫向傳播能力比較
    2.7 插入 ALV-LTR 的重組 MDV 的構(gòu)建及其生物學活性的比較研究
        2.7.1 插入ALV-LTR 片段的重組MDV 的構(gòu)建
        2.7.2 重組MDVGX0101-ALV-LTR 的拯救
        2.7.3 GX0101-ALV-LTR 在細胞上的復(fù)制能力
        2.7.4 間接免疫熒光鑒定GX0101-ALV-LTR SORF2 蛋白的表達
        2.7.5 GX0101-ALV-LTR 在CEF 細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性鑒定
        2.7.6 GX0101-ALV-LTR 的致病性檢測及雞體內(nèi)的穩(wěn)定性鑒定
    2.8 LTR 插入片段對重組病毒的病毒基因表達以及重組病毒對宿主基因表達的影響
        2.8.1 不同CEF 細胞感染不同重組病毒的總RNA 提取
        2.8.2 樣品的RNA 的放大和熒光標記
        2.8.3 Agilent 表達譜芯片雜交
        2.8.4 Agilent 表達譜芯片掃描
        2.8.5 Agilent 表達譜芯片結(jié)果的質(zhì)控檢測
        2.8.6 重組病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 與GX0101 LTR 的病毒基因差異表達的分析
        2.8.7 重組病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 與GX0101 LTR 對宿主基因表達的差異性分析
        2.8.8 GX0101 重組REV-LTR 片段對其重組位點后的基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
3 結(jié)果與分析
    3.1 GX0101 的全基因組序列的測定和比較分析
        3.1.1 GX0101 的基因組結(jié)構(gòu)以及與其它不同株 MDV 的系統(tǒng)進化關(guān)系
        3.1.2 從 GX0101 全基因組水平比較分析 REV-LTR 插入片段
        3.1.3 相對其它毒株 GX0101 基因組中缺失的片段
        3.1.4 相對其它毒株 GX0101 基因組中增加的片段
        3.1.5 GX0101 基因組的開放閱讀框和單核苷酸多態(tài)性
        3.1.6 GX0101 與英國分離株 C12/130 感染性克隆的基因組差異比較
    3.2 以 GX0101 構(gòu)建 meq 基因缺失疫苗候選株及其安全性免疫保護效果的比較
        3.2.1 SC9-1、SC9-2 疫苗候選株的構(gòu)建和鑒定
        3.2.2 SC9-1、SC9-2 株 MDV 拯救鑒定結(jié)果
        3.2.3 SC9-1、SC9-2 株 MDV 在細胞上的復(fù)制能力
        3.2.4 SC9-1 株 MDV 在雞體內(nèi)的增殖水平
        3.2.5 SC9-1、SC9-2 株 MDV 對 SPF 雞的安全性
        3.2.6 SC9-1、SC9-2 株 MDV 對 SPF 雞的免疫保護效果
        3.2.7 SC9-1 株 MDV 對海蘭褐蛋雞的免疫保護效果
        3.2.8 SC9-1 株 MDV 對 SPF 雞感染低劑量 rMd5 的免疫保護效果
        3.2.9 SC9-1 疫苗候選株中試產(chǎn)品與 CVI988/Rispens 疫苗的保護性免疫力
    3.3 GX0101 在自然感染傳播過程中競爭性選擇壓優(yōu)勢的模擬分析
        3.3.1 區(qū)分 MDV GX0101 和 GX0101 LTR 的熒光定量 PCR 探針具有良好的特異性
        3.3.2 雙重熒光定量 PCR 探針標準曲線的制備
        3.3.3 接種相同劑量 GX0101 和 GX0101 LTR 后兩種病毒在雞的接觸傳播性比較
        3.3.4 接種不同劑量 GX0101 和 GX0101 LTR 后兩種病毒在雞的接觸傳播性比較
    3.4 缺失 GX0101 SORF2 基因的重組病毒的構(gòu)建及其生物學活性的研究
        3.4.1 SORF2 融合目的蛋白的表達純化及分析鑒定
        3.4.2 間接免疫熒光(IFA)鑒定高效價多克隆抗體特異性
        3.4.3 GX0101Δsorf2 的 PCR 鑒定結(jié)果
        3.4.4 間接免疫熒光鑒定 GX0101Δsorf2 的結(jié)果
        3.4.5 Western blot 對重組病毒 GX0101 sorf2 以及 SORF2 蛋白的特異性鑒定
        3.4.6 GX0101Δsorf2 在 CEF 細胞上的復(fù)制能力
        3.4.7 GX0101Δsorf2 與親本病毒 bac-GX0101 在雞體內(nèi)的病毒血癥比較
        3.4.8 GX0101Δsorf2 對 SPF 雞的致病性
        3.4.9 GX0101Δsorf2 對雞體體液免疫應(yīng)答的影響
        3.4.10 GX0101Δsorf2 對雞體重的影響
        3.4.11 GX0101Δsorf2 和 GX0101 橫向傳播能力的比較
    3.5 插入 ALV-LTR 的重組 MDV 的構(gòu)建及其生物學活性的比較
        3.5.1 不同重組 BAC 克隆質(zhì)粒的 PCR 鑒定
        3.5.2 拯救的重組病毒 GX0101-ALV-LTR 在細胞培養(yǎng)上形成的病毒蝕斑
        3.5.3 插入 ALV-LTR 片段對重組 MDV SORF2 基因的轉(zhuǎn)錄和表達影響
        3.5.4 GX0101-ALV-LTR 在細胞上復(fù)制性能
        3.5.5 GX0101-ALV-LTR 基因組中 ALV-LTR 片段穩(wěn)定性的鑒定
        3.5.6 GX0101-ALV-LTR 對 SPF 雞體重的影響
        3.5.7 GX0101-ALV-LTR 對 SPF 雞抗體水平的影響
        3.5.8 GX0101-ALV-LTR 對 SPF 雞的致死率和致腫瘤率
    3.6 LTR 插入片段對重組病毒的病毒基因表達以及重組病毒對宿主基因表達的影響
        3.6.1 樣品總 RNA 的提取和質(zhì)檢結(jié)果
        3.6.2 Agilent 表達譜芯片結(jié)果的質(zhì)控檢測結(jié)果
        3.6.3 Agilent 表達譜芯片掃描數(shù)據(jù)歸一化結(jié)果
        3.6.4 重組病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 與GX0101 LTR 的病毒基因差異表達的分析結(jié)果
        3.6.5 感染 GX0101、GX0101-ALV-LTR、GX0101 LTR 雞的顯著差異表達基因的分析結(jié)果
        3.6.6 Northern blot 技術(shù)對重組病毒 SORF2、US1、US10 基因的鑒定結(jié)果
        3.6.7 熒光定量 PCR 檢測重組病毒 SORF2、US1、US10 基因表達結(jié)果
4 討論
5 結(jié)論
6 參考文獻
7 附錄
8 致謝
9 攻讀學位期間發(fā)表論文情況



本文編號：3760737