實驗旨在構(gòu)建敖漢細毛羊Chordin、BMP6基因表達載體,以及將其單、共轉(zhuǎn)染至成纖維細胞中,分析mRNA、蛋白表達量的變化并探究兩基因間的相互作用。采集40日齡的胎羊皮膚組織樣品,通過PCR反應(yīng)擴增目的基因（Chordin、BMP6基因）片段,利用SoSo試劑盒將目的片段與表達載體pcDNA3.1連接。鑒定正確后,將pcDNA3.1-Chordin和pcDNA3.1-BMP6轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細胞振蕩培養(yǎng)。提取質(zhì)粒,將構(gòu)建好的質(zhì)粒pcDNA3.1-Chordin、pcDNA3.1-BMP6單、共轉(zhuǎn)染至成纖維細胞中。通過熒光定量PCR和Western Blot技術(shù)檢測Chordin和BMP6轉(zhuǎn)染后表達量的變化并探究兩基因間的作用關(guān)系。結(jié)果表明:利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了Chordin、BMP6基因的表達載體,共轉(zhuǎn)染成纖維細胞后Chordin基因的表達量明顯升高且共轉(zhuǎn)染組的表達量極顯著高于單轉(zhuǎn)染組,BMP6基因的表達量明顯下降,且共轉(zhuǎn)染組的表達量極顯著低于單轉(zhuǎn)染組。Chordin基因抑制了BMP6基因的表達,BMP6基因促進了Chordin基因的表達。 

【文章頁數(shù)】：6 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 實驗材料
    1.2 實驗方法
        1.2.1 引物設(shè)計
        1.2.2 Chordin、BMP6基因與pcDNA3.1質(zhì)粒同源重組對pcDNA3.1質(zhì)粒進行EcoR I、Kpn I單酶切，酶切體系：
        1.2.3 成纖維細胞的培養(yǎng)
        1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染
        1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染后的RT-PCR擴大培養(yǎng)轉(zhuǎn)染成功的單細胞
        1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染后Western Blot檢測蛋白表達
2 結(jié)果
    2.1 目的基因擴增
    2.2 pcDNA3.1載體單酶切及純化
    2.3 表達載體pcDNA3.1與目的片段重組及鑒定
    2.4 細胞培養(yǎng)
    2.5 實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達
    2.6 Westren Blot檢測蛋白的表達
3 討論
4 結(jié)論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Wnt信號通路與腫瘤發(fā)生的研究進展[J]. 丁界先,張津,陳永剛,王興文,王栓科.  實用腫瘤學(xué)雜志. 2019(01)
[2]利用同源重組構(gòu)建BMP6基因真核表達載體及在成纖維細胞中表達量的研究[J]. 張夢瑤,楊峰,劉開東,劉積鳳,柳楠,賀建寧.  中國畜牧雜志. 2018(08)
[3]敖漢細毛羊DKK1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在成纖維細胞中表達量的研究[J]. 張夢瑤,楊峰,劉開東,程明,王國義,劉積鳳,柳楠,賀建寧.  中國畜牧獸醫(yī). 2018(01)
[4]BMPR1B基因在細毛羊皮膚毛囊中的表達及與羊毛性狀關(guān)系的研究[J]. 王小佳,賀建寧,程明,劉開東,劉積鳳,柳楠.  中國畜牧雜志. 2017(01)
[5]敖漢細毛羊不同部位皮膚毛囊發(fā)育及形態(tài)結(jié)構(gòu)研究[J]. 柳楠,王春亮,賀建寧,程明,劉開東,劉積鳳,趙金山.  中國畜牧雜志. 2015(17)
[6]綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）的生物信息學(xué)分析[J]. 樊振華,張秋月,范瑞文,任玉紅.  中國畜牧獸醫(yī). 2015(06)
[7]Hox基因家族對細毛羊羊毛性狀影響的研究[J]. 柳楠,卜然,賀建寧,程明,劉開東,劉積鳳,趙金山.  中國畜牧雜志. 2014(23)
[8]內(nèi)蒙古絨山羊毛囊不同發(fā)育時期BMP2、Noggin及SHH基因在皮膚中的表達[J]. 蘇蕊,張文廣,常子麗,王瑞軍,李金泉.  揚州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2009(01)
[9]敖漢細毛羊品種形成與發(fā)展前景[J]. 劉海山,李恒榮,于洪杰,劉俊茹,張富.  當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè). 2001(08)

碩士論文
[1]草魚抗病毒轉(zhuǎn)基因P0代的構(gòu)建和魚類Chordin基因的克隆及其對金魚尾型的影響[D]. 秦波.上海海洋大學(xué) 2015



本文編號：3700822