【摘要】：奶牛乳腺發(fā)育和泌乳受到多種信號通路的嚴(yán)格調(diào)控,揭示和闡明泌乳相關(guān)的信號通路以及乳腺代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是泌乳生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容,為提高奶品質(zhì)和奶產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。Folliculin(FLCN)基因作為抑癌基因,廣泛參與多種代謝途徑和細(xì)胞過程,在細(xì)胞粘附、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成和線粒體生物合成等方面發(fā)揮重要作用,但在奶牛乳腺中FLCN的表達(dá)及其功能未見報(bào)道。本研究針對FLCN在細(xì)胞代謝、增殖、凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的功能以及相互作用蛋白進(jìn)行分析,旨在揭示FLCN調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳蛋白合成的分子機(jī)理。實(shí)驗(yàn)首先采用激光共聚焦檢測FLCN在青春期、泌乳期和干奶期奶牛乳腺組織中的表達(dá),以鑒定FLCN在奶牛乳腺發(fā)育各時期的表達(dá)定位及表達(dá)差異。為確定FLCN對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和泌乳的作用,本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型,對FLCN進(jìn)行基因干擾和過表達(dá)調(diào)控,并采用 qRT-PCR 和 Western blot 檢測 AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1、Caspase3和β-酪蛋白的表達(dá),同時利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)通過Co-IP和質(zhì)譜鑒定技術(shù)研究FLCN與腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)的相互作用關(guān)系。為進(jìn)一步確定FLCN對AMPK信號通路的調(diào)控作用,本研究對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中FLCN基因進(jìn)行過表達(dá)和干擾,并在培養(yǎng)基中分別添加AMPK激活劑和抑制劑,Western blot 檢測 FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1 和 β-酪蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)通過無糖培養(yǎng)基處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞,并利用qRT-PCR和Western blot檢測無糖培養(yǎng)條件下 FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1、ACC 和 β-酪蛋白表達(dá)變化,研究FLCN對奶牛乳腺上皮細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)作用。激光共聚焦檢測結(jié)果顯示FLCN主要定位于奶牛乳腺上皮細(xì)胞,并且在青春期和泌乳期乳腺組織中高表達(dá),干奶期乳腺組織表達(dá)較低,說明FLCN可能參與奶牛乳腺發(fā)育和泌乳的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了 FLCN過表達(dá)和抑制對乳蛋白合成、細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示,FLCN過表達(dá)可以上調(diào)mTOR和β-酪蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,并促進(jìn)mTOR發(fā)生磷酸化,而抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果與過表達(dá)相反。細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示,過表達(dá)FLCN使細(xì)胞數(shù)明顯增加,且細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)。此外,過表達(dá)FLCN的乳腺上皮細(xì)胞增殖率顯著高于空白對照組和轉(zhuǎn)染空載體組,且處于S期和G2-M期的細(xì)胞百分比均明顯升高,而G1期細(xì)胞百分比明顯下降。抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果與過表達(dá)相反。過表達(dá)和抑制FLCN實(shí)驗(yàn)還顯示FLCN正調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá),結(jié)合流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果說明FLCN促進(jìn)細(xì)胞增殖。另外,結(jié)果顯示FLCN負(fù)調(diào)節(jié)凋亡蛋白Caspase3的表達(dá),同時發(fā)現(xiàn)FLCN負(fù)向調(diào)控AMPK表達(dá)水平,并且抑制其磷酸化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FLCN正向調(diào)節(jié)mTOR的磷酸化水平從而促進(jìn)乳蛋白合成和細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,并且負(fù)調(diào)控AMPK。本實(shí)驗(yàn)通過Co-IP和質(zhì)譜鑒定技術(shù)研究FLCN與AMPK的相互作用關(guān)系。結(jié)果顯示,當(dāng)采用AMPK抗體進(jìn)行Co-IP時,在IP產(chǎn)物中檢測到FLCN及其結(jié)合蛋白FINP1;采用FINP1抗體進(jìn)行Co-IP時,在IP產(chǎn)物中檢測到AMPK和FLCN蛋白。結(jié)果表明FLCN及其結(jié)合蛋白FINP1與AMPK存在相互作用關(guān)系,提示FLCN參與AMPK信號通路的調(diào)節(jié)。本研究對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中FLCN基因進(jìn)行過表達(dá)和干擾,并在培養(yǎng)基中分別添加AMPK激活劑和抑制劑,進(jìn)一步確定FLCN對AMPK信號通路的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,當(dāng)AMPK激活時,FLCN蛋白表達(dá)升高,mTOR表達(dá)及磷酸化降低,Cyclin D1和β-酪蛋白的表達(dá)降低。AMPK活性抑制時結(jié)果相反。研究結(jié)果表明AMPK正調(diào)控FLCN的表達(dá),負(fù)調(diào)控mTOR表達(dá)及活性,抑制乳蛋白合成和細(xì)胞增殖。結(jié)合之前的研究結(jié)果FLCN過表達(dá)抑制AMPK的表達(dá)及磷酸化,AMPK激活反而促進(jìn)FLCN的表達(dá),這樣AMPK與FLCN形成負(fù)反饋?zhàn)饔�。本�?shí)驗(yàn)又研究了 FLCN對奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳腺能量代謝的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,無糖培養(yǎng)條件下AMPK和FLCN表達(dá)升高,AMPK磷酸化升高,乳蛋白合成通路重要調(diào)節(jié)蛋白mTOR表達(dá)和磷酸化降低,β-酪蛋白表達(dá)降低,乳脂合成相關(guān)酶ACC基因和蛋白表達(dá)降低。研究結(jié)果表明當(dāng)乳腺上皮細(xì)胞能量缺乏時,細(xì)胞能量感受器AMPK被激活,抑制合成代謝,同時FLCN表達(dá)升高動態(tài)調(diào)節(jié)AMPK活性,抑制細(xì)胞凋亡,維持能量缺乏早期細(xì)胞存活。上述實(shí)驗(yàn)證明FLCN通過AMPK信號通路參與奶牛乳腺上皮細(xì)胞的能量代謝調(diào)節(jié)。綜上所述,FLCN促進(jìn)乳蛋白合成和細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,并且FLCN參與乳腺上皮細(xì)胞中AMPK信號通路的調(diào)節(jié),FLCN與AMPK之間存在負(fù)反饋關(guān)系。
【圖文】：

Ｎｏｔｅ：邋Ａ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋Ｂ：邋ＣＫ１８邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ；邋ＤＡＰＩ－ｌａｂｅｌｅｄ邋ｎｕｃｌｅｉ邋（ｂｌｕｅ），邋ＦＩＴＣ－Ｉａｂｅｌｅｄ邋ＣＫ邋１８逡逑（ｇｒｅｅｎ）；邋ｓｃａｌｅ：邋３Ｏｆｉｍ逡逑圖３－３奶牛乳腺上皮細(xì)胞ＣＫ１８鑒定逡逑Ｆｉｇ．３－３邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＫ１８邋ｉｎ邋ＢＭＥＣｓ逡逑３．３邋ＦＬＣＮ對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡和乳蛋白合成的影響逡逑３．３．１邐ＦＺＣＷ干擾對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡和乳蛋白合成的影響逡逑３．３．１．１邐ＦＬＣ７Ｖ最佳干擾片段的篩選逡逑由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成ＦＬＣ７Ｖ基因干擾片段轉(zhuǎn)染到ＢＭＥＣｓ中，４８ｈ后收集細(xì)胞樣品，逡逑ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測各組樣品中ＦＬＣＷｍＲＮＡ表達(dá)，篩選出干擾效果最好的片段。結(jié)果如圖３－４所逡逑示，ｓｉＲＮＡ－２的干擾片段轉(zhuǎn)染后，凡ＣＷｒａＲＮＡ表達(dá)低于轉(zhuǎn)染ｓｉＲＮＡ－１和ｓｉＲＮＡ－３干擾片段，逡逑由此表明ｓｉＲＮＡ－２片段為最佳干擾片段可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑２邋１．５－．逡逑！邋°邋ｉ自逡逑ｉ：邋Ｊ邋Ｊ邋ｌｌ逡逑ＣＯＮ邋ｓｉＲＮＡ－１邋ｓｉＲＮＡ－２邋ｓｉＲＮＡ－３逡逑圖３－４ＦＬＣ７Ｖ最佳干擾片段的篩選；代表差異顯著（Ｐ＜０．０５）；邋“＊＊”代表差異極顯著逡逑（Ｐ＜０．０１）逡逑Ｆｉｇ．３－４邋Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｂｅｓｔ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ邋ｆｒａｇｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ＦＬＣＮ；邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ逡逑＜０．０５）；“＊＊”邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋

３．３．１．２轉(zhuǎn)染ＦＬＣＷ干擾片段逡逑轉(zhuǎn)染ＦＩＣＷ干擾片段并于６ｈ后在熒光顯微鏡下觀察。ＦＬＣＷ干擾片段具有ＦＡＭ綠色熒逡逑光基團(tuán)，可在顯微鏡下觀察到綠色的熒光，由此可檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果如圖３－５所示，視野逡逑中綠色熒光分布廣泛，說明轉(zhuǎn)染成功效率較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑圖３－５邋ＦＬＯＶ干擾片段的轉(zhuǎn)染效率逡逑Ｆｉｇ．３－５邋Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ｏｆ邋ＦＬＣＮ邋ｓｉＲＮＡ逡逑３．３．１．３邐ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡和乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)逡逑實(shí)驗(yàn)分為空白對照組（Ｂｌａｎｋ）、陰性對照組（ＮＣ）和／＝ＸＣＷ干擾組（ＦＩＣＷＫＤ）。轉(zhuǎn)染逡逑４８邋ｈ后，，收集細(xì)胞樣品。ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測細(xì)胞增殖、凋亡和乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)逡逑結(jié)果如圖３－６所示，與陰性對照組相比，ＦＬＣＷ干擾后Ｗ：ＣＷ、Ｃ＿ｙｃ／／？Ｄ／和（３－酪蛋白逡逑的ｍＲＮＡ表達(dá)降低，說明ＦＩＣ７Ｖ干擾后乳蛋白合成下降，細(xì)胞增殖減少。ＪＭＰ尺和逡逑的ｍＲＮＡ表達(dá)顯著升高，說明Ｆ￡ＣＷ干擾后細(xì)胞凋亡增加，尺表達(dá)受其調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑表明，ＦＬＣ７Ｖ調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡和乳蛋白合成。逡逑■Ｈ邋Ｂｌａｎｋ逡逑□邋ＮＣ逡逑２邋１，５１邐ｉｚａ邋ＦＩＸＮ邋ＫＤ逡逑ＩｋｆｌｌＭ逡逑ＦＬＣＮ邋ｍＴＯＲ邋ＡＭＰＫ邋ＣｖｃＩｉｎＤｌ邋｜Ｈ：ａ？ｅｉｎ邋ｃａＭｐａｓｅｉ逡逑圖３－６邋ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測細(xì)胞增殖、凋亡和乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)；代表差異顯著逡逑（Ｐ＜０．０５）；邋“＊＊”代表差異極顯著（Ｐ＜０．０１）逡逑Ｆｉｇ．３－６邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2614639