【摘要】：J亞群禽白血病是由反轉(zhuǎn)錄病毒科的J亞群禽白血病病毒(ALV-J)引起的主要以髓細(xì)胞過(guò)度增生的可傳染的腫瘤性疾病,主要引起機(jī)體的生長(zhǎng)抑制、免疫抑制以及多器官組織出現(xiàn)腫瘤。我國(guó)于1999年首次發(fā)現(xiàn)肉雞感染此病毒后,發(fā)現(xiàn)其宿主范圍不斷擴(kuò)大,不僅感染蛋雞,而且向地方種雞擴(kuò)散;致瘤譜擴(kuò)展、致瘤性明顯增強(qiáng),發(fā)病日齡提前,出現(xiàn)淋巴細(xì)胞瘤、血管瘤、纖維肉瘤、成紅細(xì)胞瘤等多種腫瘤,給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了極大的損失。鑒于病毒高度變異特性以及免疫逃避機(jī)制,傳統(tǒng)弱毒疫苗、滅活疫苗尚不能提供有效的保護(hù)能力,國(guó)外對(duì)于此病的防控措施主要是通過(guò)種源凈化的方式,不斷淘汰感染陽(yáng)性雞群,取得了較好的效果,但養(yǎng)殖成本相對(duì)較高。而我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)水平相對(duì)較低,行業(yè)發(fā)展程度不高,難以完全通過(guò)凈化的方式控制疾病的發(fā)生。目前,ALV-J在我國(guó)流行形勢(shì)嚴(yán)峻,亟需開(kāi)發(fā)有效的新型疫苗。表位疫苗是一種新型亞單位疫苗,越來(lái)越受到更廣泛的關(guān)注和研究,其優(yōu)勢(shì)眾多,可以克服傳統(tǒng)疫苗造成的毒力恢復(fù)或散毒的可能�？乖砦浑亩绦〉庖咴愿鼜�(qiáng),可以克服組織相容復(fù)合體的遺傳限制。對(duì)于ALV-J這種高度變異的病毒,多表位疫苗含有廣譜的表位信息,可以避免毒株的變異導(dǎo)致的免疫失敗,從而提供更完全、更有針對(duì)性的免疫保護(hù),為疾病的防控凈化提供了條件。篩選和鑒定更多的抗原表位,不僅有助于了解病毒抗原結(jié)構(gòu),而且為表位疫苗的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)首先獲得ALV-J病毒結(jié)構(gòu)和抗原相關(guān)信息,采用預(yù)測(cè)法分析囊膜蛋白的抗原表位,篩選出代表近幾年中國(guó)流行毒株的表位基因序列,采用編碼甘氨酸、絲氨酸的密碼子進(jìn)行串聯(lián),基因片段cENV由生物公司合成后構(gòu)建原核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá),選用不同表達(dá)載體對(duì)表達(dá)重組蛋白純度進(jìn)行優(yōu)化選擇,純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定和Western Blot分析,確定重組蛋白獲得高效表達(dá)并且具有免疫原性后進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)。通過(guò)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獲得的重組蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性,并且刺激雞體產(chǎn)生高效價(jià)的抗體,抗體維持時(shí)間接近14周。利用制備的高效價(jià)血清進(jìn)行體外病毒中和實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示具有明顯的病毒中和效果,達(dá)到40%-50%。對(duì)于高度變異的病毒,有必要進(jìn)一步精確定位超變區(qū)的抗原表位,完善表位圖譜,增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。我們先將gp85片段分段進(jìn)行原核表達(dá),利用實(shí)驗(yàn)室制備的針對(duì)ALV-J gp85超變區(qū)的單抗2D5,對(duì)分段表達(dá)的抗原片段進(jìn)行分析,初步確定抗原表位肽段區(qū)域,進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成小肽進(jìn)行表位映射,精確定位了超變區(qū)hr1抗原表位序列為L(zhǎng)RDFIAKWKSDDLLIRPYVNQS。經(jīng)過(guò)表位氨基酸序列同源性比對(duì)分析,我們發(fā)現(xiàn)表位主要存在三個(gè)位點(diǎn)的氨基酸變異,變異氨基酸主要在于第六位氨基酸A變?yōu)镋或T,針對(duì)氨基酸變異設(shè)計(jì)合成小肽分析氨基酸變異對(duì)表位抗原性的影響。確定此位點(diǎn)氨基酸變異是導(dǎo)致表位抗原性改變的關(guān)鍵氨基酸。利用臨床采集的ALV-J陽(yáng)性血清,進(jìn)一步分析變異前后表位肽的免疫原性,結(jié)果顯示不同表位肽均只與陽(yáng)性血清反應(yīng),說(shuō)明我們鑒定的表位肽具有良好的反應(yīng)原性,也初步確定感染ALV-J的雞群產(chǎn)生的抗體存在多種狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)研究鑒定的抗原表位,豐富了ALV-J抗原圖譜,為構(gòu)建安全有效的多表位疫苗奠定了基礎(chǔ),為疾病的防控凈化提供了條件。
【圖文】：

篩選出代表當(dāng)前流行鑒定GGT、GGG、GGA）、絲氨掉稀有密碼子［精氨酸 Arg Ile（ATA）、脯氨酸 Pro（ 998bp，由生工生物工程（受態(tài)細(xì)胞中，大量擴(kuò)增后提糖凝膠上電泳，，結(jié)果顯示目1 M

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)方 法 ， 將 構(gòu) 建 成 功 的 表 達(dá) 菌 BL21-p 活化，待菌液活化至 OD600約為 0.8-1.0 時(shí)，加入達(dá)。預(yù)表達(dá) 3h 后收菌進(jìn)行超聲破碎提取蛋白，用E 分析。結(jié)果顯示，兩株表達(dá)菌均表達(dá)出目的蛋相符，并且主要以包涵體形式表達(dá)在沉淀中（個(gè)表達(dá)載體比較來(lái)看，pET-30a 表達(dá)蛋白明顯純，非常有利于蛋白的大量表純化。對(duì)于大批量動(dòng)以往經(jīng)驗(yàn)，蛋白經(jīng)過(guò)純化后濃度會(huì)相應(yīng)降低很很好的解決實(shí)驗(yàn)困難。我們確定選用 pET-30a 大
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 成子強(qiáng),張利,劉思當(dāng),張玲娟,崔治中;中國(guó)麻雞中發(fā)現(xiàn)禽J亞群白血病[J];微生物學(xué)報(bào);2005年04期

2 陳洪博;于琳琳;姜艷萍;王s

本文編號(hào)：2583362