本文關鍵詞：禽呼腸孤病毒感染對體外細胞和SPF雞Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄影響的初步研究

  更多相關文章： 禽呼腸孤病毒 雞Toll樣受體 real-time PCR 轉(zhuǎn)錄水平

【摘要】：禽呼腸孤病毒(Avian reovirus, ARV)是重要的家禽病原體之一,可導致雞病毒性關節(jié)炎、免疫抑制、呼吸障礙綜合征等,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。前人研究表明, ARV的研究方向有病毒檢測方法的建立、病原體的分離鑒定、病毒基因組的測序等幾個方面,然而對于ARV在分子致病機制方面的研究報道并不多見。為了能夠有效防控ARV的感染,因此需要進一步對禽呼腸孤病毒進行分子致病機制方面的研究。雞Toll樣受體是天然免疫分子,能識別病原相關分子模式在機體天然免疫系統(tǒng)起防御作用,同時還能啟動獲得性免疫,是連接機體天然免疫應答和獲得性免疫的重要介質(zhì)。目前已證明雞Toll樣受體在禽流感感染、雞傳染性法氏囊病毒感染、馬立克氏病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染等致病過程中占有重要作用,但有關ARV感染導致機體雞Toll樣受體的轉(zhuǎn)錄量變化和免疫抑制的致病機制少有報道。為探討ARV感染對雞Toll樣受體ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的mRNA轉(zhuǎn)錄的影響,本研究首先建立了雞ChTLR3、ChTLR5、 ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的mRNA的SYBR Green II實時熒光染料相對定量PCR檢測方法,體內(nèi)外試驗分別用ARV標準強毒株S1133株感染7日齡SPF雛雞和體外雞胚成纖維細胞(CEF), real-time PCR方法檢測與分析ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21在體外CEF細胞和SPF雞體內(nèi)不同組織器官(外周血淋巴細胞、肝臟、心臟、胸腺、脾臟、法氏囊和關節(jié))中不同試驗時間點的相對轉(zhuǎn)錄量變化情況。根據(jù)GenBank上公布的雞ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21和內(nèi)參基因(GAPDH)序列,運用生物軟件設計特異性引物并送公司合成。抽提SPF雞脾臟的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模版構建的重組質(zhì)粒,繪制雞Toll樣受體SYBR Green Ⅱ?qū)崟r熒光染料相對定量PER標準曲線。結果表明所檢測的受體基因的溶解曲線均為單峰,擴增效率接近100%,線性相關性大于0.99,基因檢測下限達到熒光定量檢測要求。說明本研究建立的Toll樣受體檢測方法可以應用于熒光定量檢測。運用已建立雞Toll樣受體的熒光定量PER檢測方法,檢測ARV標準強毒株S1 133感染雞胚成纖維細胞CEF后,ARV結構蛋白σC和ChTLR3、ChTLR5、 ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的動態(tài)轉(zhuǎn)錄水平。檢測結果發(fā)現(xiàn),ARV感染CEF后其結構蛋白于48h時相對轉(zhuǎn)錄量顯著上調(diào)并且達到峰值(P0.01)；同時,感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21 mRNA相對轉(zhuǎn)錄量發(fā)生顯著變化,在感染72h內(nèi)各個受體的mRNA相對轉(zhuǎn)錄量呈波浪式變化。ChTLR3 mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染后24h上調(diào)6.5倍；ChTLR5 mRNA相對轉(zhuǎn)錄量分別在感染前期(10h)和后期(72h)分別達到峰值,其相對轉(zhuǎn)錄量分別上調(diào)20.67倍和18.38倍;ChTLR7 mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染后6h達到峰值,相對轉(zhuǎn)錄量為對照組的9.22倍；ChTLR15 mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染12h呈現(xiàn)峰值,相對轉(zhuǎn)錄量上調(diào)14.23倍；ChTLR21mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染10h后上調(diào)13.74倍。五個不同滴度的ARV病毒感染CEF24h后,ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與病毒滴度均呈正線性相關。上述試驗結果表明： ARV感染后可誘導CEF中ChTLR3、 ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化,提示可能與禽呼腸孤病毒的復制和致病機制相關。動物試驗7日齡SPF經(jīng)足墊途徑注射ARV標準強毒S1133株,real-time染料相對定量PCR方法分別檢測感染雞后不同組織器官(外周血淋巴細胞、肝臟、心臟、胸腺、脾臟、法氏囊和關節(jié))中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的相對轉(zhuǎn)錄量變化情況。檢測結果發(fā)現(xiàn),ARV感染可引起上述雞Toll樣受體mRNA在不同試驗時間點轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著的變化,以此推測上述Toll樣受體相對轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV感染SPF雞后引起的不同組織器官損傷有關。其中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA在關節(jié)中相對轉(zhuǎn)錄量發(fā)生顯著變化,ARV感染后第3d相對轉(zhuǎn)錄量顯著上調(diào),隨后第14d相對轉(zhuǎn)錄量顯著下調(diào)(P0.05 or P0.01),推測這些受體的相對轉(zhuǎn)錄量變化可能與ARV感染導致的關節(jié)病變有關。心臟中ChTLR3、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染第3d顯著上調(diào)(P0.01 or P0.05),推測以上受體的相對轉(zhuǎn)錄量的改變可能與ARV感染引起的心臟損傷相關聯(lián)。肝臟中ChTLR3基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染第1d顯著上調(diào)(P0.05),而ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染第3d顯著上調(diào)(P0.05 or P0.01),推測它們相對轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV感染所致的肝臟臟損傷相關。ChTLR3、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在不同免疫器官(胸腺、脾臟和法氏囊)中均有不同程度的上調(diào),其中免疫器官中ChTLR3基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染第1 d顯著上調(diào)(P0.05 or P0.01)；脾臟中ChTLR7基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染第5d顯著上調(diào)(P0.01),ChTLR7基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在胸腺和法氏囊中在免疫器官中在感染第1d顯著上調(diào)(P0.05),其他受體在不同時間點相對轉(zhuǎn)錄量也有明顯的變化,推斷免疫器官中各個受體相對轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV引起的免疫抑制有關。外周血淋巴細胞中ChTLR3和ChTLR21基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染第1d顯著下調(diào),前者至第7d顯著下調(diào)到最低值,而后者開始慢慢上調(diào)(P0.05 or P0.01)；ChTLR7基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄量在感染第7d顯著上調(diào)并達到峰值(P0.01)；其他受體的相對轉(zhuǎn)錄量也有明顯的變化,提示它們相對轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV感染所致外周血淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)相關。本研究完成了禽呼腸孤病毒感染的體外雞胚成纖維細胞和SPF雞組織器官以及外周血淋巴細胞中雞Toll樣受體(ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21)基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄量動態(tài)的檢測結果,從體外細胞和體內(nèi)SPF雞體兩個試驗模型分析了不同雞Toll樣受體在ARV感染后相對表達量的變化,旨在更好的研究禽呼腸孤病毒的致病機制。
【關鍵詞】：禽呼腸孤病毒 雞Toll樣受體 real-time PCR 轉(zhuǎn)錄水平
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 論文中的英文縮寫及中文對照表13-17
• 第一章 文獻綜述17-25
• 1.1 禽呼腸孤病毒研究的進展17-20
• 1.1.1 禽呼腸孤病毒的簡介17-18
• 1.1.2 ARV的形態(tài)和結構18-19
• 1.1.3 ARV的增殖特性19
• 1.1.4 禽呼腸孤病毒的診斷與防治19-20
• 1.2 雞Toll樣受體的研究進展20-22
• 1.2.1 Toll樣受體的概念20
• 1.2.2 Toll樣受體的結構與分類20-21
• 1.2.3 雞Toll樣受體的功能21-22
• 1.3 SYBR Green Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR22-23
• 1.3.1 SYBR Green Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR原理22-23
• 1.3.2 SYBR Green Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR應用23
• 1.4 本課題研究的意義23-25
• 第二章 雞TLR3、TLR5、TLR7、TLR15、TLR21 mRNA實時熒光定量PCR檢測方法的建立25-37
• 2.1 材料與方法26-30
• 2.1.1 主要儀器與試劑26
• 2.1.2 引物設計與合成26-27
• 2.1.3 SPF雞脾臟RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄27-28
• 2.1.4 標準品制備28-29
• 2.1.5 目的基因條件的優(yōu)化29
• 2.1.6 目的基因標準曲線試驗29
• 2.1.7 溶解曲線試驗29-30
• 2.1.8 敏感性試驗30
• 2.1.9 重復性試驗30
• 2.2 結果30-36
• 2.2.1 RNA抽提結果30-31
• 2.2.2 質(zhì)粒標準品的制備結果31
• 2.2.3 real-time PCR條件優(yōu)化結果31-32
• 2.2.4 各個目的基因標準曲線的制作結果32-33
• 2.2.5 溶解曲線試驗結果33-34
• 2.2.6 各個基因的敏感性試驗結果34-36
• 2.2.7 重復性試驗結果36
• 2.3 討論36-37
• 第三章 禽呼腸孤病毒感染體外雞胚成纖維細胞后Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化37-45
• 3.1 材料與方法39-41
• 3.1.1 病毒39
• 3.1.2 主要試驗試劑和儀器39
• 3.1.3 細胞的制備與培養(yǎng)39
• 3.1.4 呼腸孤病毒TCID50測定39
• 3.1.5 呼腸孤病毒感染方法39-40
• 3.1.6 收集細胞樣品40
• 3.1.7 CEF細胞的RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄40
• 3.1.8 樣品測定40
• 3.1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析40-41
• 3.2 結果41-44
• 3.2.1 ARV病毒結構蛋白6C基因的相對轉(zhuǎn)錄變化41
• 3.2.2 ARV S1133株感染CEF后雞Toll樣受體的轉(zhuǎn)錄水平變化41-43
• 3.2.3 不同接種劑量ARV感染CEF細胞24h后雞Toll樣受體的表達變化43-44
• 3.3 討論44-45
• 第四章 ARV感染對SPF雞組織器官中5種雞Toll樣受體mRNA相對轉(zhuǎn)錄的影響45-70
• 4.1 材料與方法47-48
• 4.1.1 主要試劑和儀器47
• 4.1.2 試驗動物47
• 4.1.3 ARV感染SPF雞試驗47
• 4.1.4 SPF雞剖檢及組織樣品采集47
• 4.1.5 采集樣品的RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄47-48
• 4.1.6 試驗樣品的Real-time PCR測定48
• 4.1.7 試驗數(shù)據(jù)處理和分析48
• 4.2 結果48-67
• 4.2.1 SPF雞感染呼腸孤病毒后的臨床表現(xiàn)48-54
• 4.2.1.1 SPF雞體重及各個器官的變化情況48-53
• 4.2.1.2 SPF雞感染ARV后各個器官的臨床表現(xiàn)53-54
• 4.2.2 關節(jié)中5種雞Toll樣受體mRNA相對轉(zhuǎn)錄量的變化54-56
• 4.2.3 心臟中5種雞Toll樣受體mRNA相對轉(zhuǎn)錄量的變化56-58
• 4.2.4 肝臟中5種雞Toll樣受體mRNA相對轉(zhuǎn)錄量的變化58-60
• 4.2.5 脾臟中5種雞Toll樣受體mRNA相對轉(zhuǎn)錄量的變化60-62
• 4.2.6 胸腺中5種雞Toll樣受體mRNA相對轉(zhuǎn)錄量的變化62-64
• 4.2.7 法氏囊中5種雞Toll樣受體mRNA相對轉(zhuǎn)錄量的變化64-65
• 4.2.8 外周血淋巴細胞中5種雞Toll樣受體基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄量的變化65-67
• 4.3 討論67-70
• 結論70-71
• 參考文獻71-76
• 致謝76-77
• 個人簡歷77
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況77

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